原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-35487-9
背景介绍
Wnt信号通路对肠道干细胞增殖和维持至关重要，其信号传导减少，会导致干细胞活性降低和再生受损。不依赖于β-catenin的Wnt信号传导被称为非典型Wnt信号传导，可以通过配体Wnt与受体FZD及辅受体Ror2、Ryk和蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）结合而触发，导致JNK和Ca2+信号的激活。非典型的Wnt信号导致细胞骨架重排，影响细胞迁移和平面细胞极性。
Ptk7，也称为结肠癌激酶4（CCK4），是受体酪氨酸激酶（RTK）家族的成员，其N末端包含免疫球蛋白样重复序列（Ig）。Ptk7的细胞外结构域在被金属蛋白酶切割后可以脱落，随后转移到细胞核。损伤诱导的基质金属蛋白酶表达促进Ptk的N末端结构域从肠内分泌细胞脱落，诱导肠道干细胞中的非典型Wnt信号传导，并促进其向伤口迁移。
虽然经典的Wnt信号已被证明在肠道干细胞活性和再生中起作用，但非典型Wnt信号是否影响肠道干细胞仍不得知。
主要结果
1. SASP在小鼠肠道类器官中影响细胞分化
作者从小鼠小肠中分离出隐窝，培养在鼠胚胎成纤维细胞的条件培养基中，这些成纤维细胞经X射线照射或多柔比星从而发生衰老（图1a）。衰老成纤维细胞条件培养基（SCM）处理的类器官表现出显著的成球性，缺乏隐窝结构，而静息成纤维细胞条件培养基（QCM）处理的类器官则表现出正常的隐窝出芽（图1b-c）。Ki67和pH3染色都表明QCM和SCM处理的类器官都表现出增殖活性，暗示暴露于SCM并不会导致类器官的继发衰老（图1d）。
接下来，作者比较了类器官中各种细胞标记物的转录水平，发现SCM类器官的分泌细胞标记物的表达量都显著减少，而其他细胞则没有（图1e-p）。有趣的是，SASP引起的形态变化时可逆的，将类器官由SCM转移至QCM时其开始出芽、囊性结构消失（图1q）。以上结果表明SCM导致肠道干细胞谱系中细胞分化的特异性和可逆性缺陷。
图1.SCM引起小鼠肠道类器官的囊性形态
2. 分泌的Ptk7是导致囊性类器官表型的SASP因子
为了鉴定SCM中导致类器官形态变化的因素，作者对SCM中各种因子进行了质朴分析，其中Ptk7的N端胞外结构域是强烈表达的，也可在肠道类器官中检测到（图2a-e）。与QCM处理的类器官相比，SCM处理的肠道类器官中含有更高水平的脱落形式的Ptk7（sPtk7）（图2f）。以上结果表明Ptk7是SASP中的常见成分之一。
图2. Ptk7鉴定为是导致囊性类器官的重要因素
许多研究表明Ptk7能与Wnt通路中的多种组分发生互作，但这种互作是否影响肠道干细胞尚不清楚（图4a）。鉴于FZD在经典及非经典Wnt通路中的作用，作者使用不同的FZD抑制剂分别处理，发现FZD7和FZD8（参与非典型Wnt信号通路）的抑制能消除类器官的囊性形态（图4b-c）。在类器官的培养基中加入Wnt配体Wnt5a和Wnt3a后能使类器官出现囊性形态，但抑制FZD或Ptk7后则能消除这一现象（图4d-i）。ELISA结合曲线表明FZD和Ptk7都能和Wnt配体结合，并且是结合于不同位点（图4j-l）。以上结果表明Ptk7/FZD7/Wnt形成三重复合物激活Wnt信号。
图4. Ptk7通过非典型Wnt信号起作用
5.抑制肠道类器官Ca2+信号能消除囊性形态
Wnt5a介导的非经典Wnt信号能通过调整胞质Ca2+控制细胞增殖和代谢，但Ca2+是否会影响肠道干细胞的功能仍不清楚。作者发现Wnt5a处理后的类器官中细胞的Ca2+基线和波动的水平和幅度都是可变的，没有明显的规律（图5a-e）。在用SCM处理类器官时也能出现相同的现象，但加入Ptk7抗体后则不能引起Ca2+波动（图5f-h）。TFP是Ca2+结合蛋白钙调蛋白的抑制剂，用TFP及其他抑制剂处理类器官后囊性形态的比例显著减少了（图5i-l）。以上结果表明Ptk7调控胞质Ca2+信号从而导致类器官的囊性形态。
图5. Ptk7调节肠道类器官胞质Ca2+
6.暴露于SASP的类器官的YAP/TEAD靶基因富集
作者通过转录组分析检测了不同处理条件下类器官的基因表达，结果发现完全培养基和QCM处理的类器官其基因表达相似，而其他处理组中基因表达则有很大不同。Wnt5a处理组中差异表达基因有一半与SCM引起的差异表达基因相同，而Wnt5a处理组与SCM处理组不同的差异表达基因则大部分都是Ptk7依赖性的（图6a-c），这进一步证明了SCM是通过非典型Wnt信号起作用的，且Ptk7在其中发挥重要作用。对转录因子结合基序的分析表明，依赖于Ptk7和非依赖于Ptk7之间有大量的差异表达基因，其中依赖于Ptk7的差异表达基因对TEAD结合基序显示出强烈的富集性（图6d）。大多数具有TEAD结合基序的依赖于Ptk7差异表达基因都在SCM或Wnt5a响应下表达上调，且都是已知的YAP靶基因（图6e）。以上结果表明SCM可能通过YAP/TEAD靶基因的表达激活导致囊性形态。
图6. Ptk7依赖性差异表达基因中TEAD结合基序富集
7.抑制YAP能逆转囊性表型
上述结果暗示Ptk7和Wnt5a可能通过激活YAP/TEAD起作用，因此作者对其进行了进一步验证。SCM或Wnt5a处理后，YAP的核定位明显增多了（图7a）。Ca2+信号传导与YAP的调节有关，加入TFP后能抑制YAP核易位（图7f）。而加入YAP或TEAD抑制剂后，囊性形态的比例明显降低了（图7b-e）。以上结果表明非典型Wnt-Ca2+信号传导促进肠道干细胞YAP/TEAD激活，引起囊性形态。
图7.YAP核定位与囊性形态有关
小结
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