神经炎症在缺血性损伤中发挥重要作用，氧化型线粒体DNA（Ox-mtDNA）可促进神经炎症的发生。胞苷单磷酸激酶2（CMPK2）调节mtDNA的复制，但其在神经炎症和缺血性损伤中的作用尚不清楚。因此本研究发现人和小鼠卒中后单核/巨噬细胞和小胶质细胞中CMPK2表达出现上调。机制上，敲低CMPK2限制了新合成的mtDNA和Ox-mtDNA的形成，从而阻断了小胶质细胞和巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活。去甲二氢愈创木酸（NDGA）作为一种CMPK2抑制剂，可以减轻小鼠的神经炎症和缺血性损伤，阻碍缺血性患者的原代单核细胞中的炎症反应。因此，这些研究为CMPK2作为缺血性脑卒中和其他与神经系统疾病的潜在治疗靶点奠定了基础。
2024年5月3日，中国药科大学天然药物国家重点实验室等机构的科学家在Cell Reports Medicine（IF：14.3）杂志上发表题目为“Microglial CMPK2 promotes neuroinflammation and brain injury after ischemic stroke”的文章，通过AAV介导的基因敲低技术、药物干预和免疫荧光等技术发现了人和小鼠卒中后小胶质细胞/巨噬细胞中的CMPK2表达上调，敲低CMPK2抑制mtDNA的合成和小胶质细胞/巨噬细胞中8-OHdG的表达，以及由Ox-mtDNA诱导的NLRP3炎症小体的活化，从而减轻缺血性损伤，为治疗缺血性脑卒中或其他神经系统疾病提供潜在治疗靶点。
主要内容
1. 脑卒中患者外周血中CMPK2表达上调且与梗死体积有关
在正常人和缺血性卒中患者之间，外周血全血中基因表达的差异被公认为是一种识别生物标志物或诊断预后缺血性卒中的方法。目前对于CMPK2在缺血性脑卒中病理过程中的作用仍有待阐明。作者评估了外周血中CMPK2基因的表达，结果显示与对照相比，缺血性脑卒中患者的CMPK2基因表达显著升高（图1A）。作者随后分析了CMPK基因表达情况与梗死体积或美国国立卫生研究院卒中量化表（National Institutes of Health Stroke Scale, NIHSS）评分的关系。结果显示CMPK2基因表达与梗死体积或NIHSS评分呈正相关，表明CMPK2可能与患者的卒中严重程度呈正相关（图1B-D）。作者进一步检测了Ox-mtDNA的生物标志物8-OHdG的表达，发现上调CMPK2促进8-OHdG的表达。免疫荧光分析显示，与对照相比，卒中后外周血中8-OHdG和CMPK2的表达增加（图1E-H）。这些结果表明，在人类脑卒中患者中，外周血中升高的CMPK2水平与卒中严重程度呈正相关。
图1 人缺血性患者中外周血CMPK2表达水平升高且与梗死体积呈正相关
2. CMPK2是缺血性脑卒中发病后小胶质细胞/巨噬细胞特异性调节因子
与在人类外周血中的发现一致，小鼠或大鼠tMCAO模型中大脑梗死周围区域CMPK2蛋白表达在3 h显著升高，24 h达到峰值，最后在7天恢复到基线水平（图2A-B）。随后作者研究了哪种细胞类型会增加缺血性脑卒中中CMPK2的表达，免疫荧光显示，卒中后CMPK2在小胶质细胞/巨噬细胞中的表达明显升高（图2C-D）。为了进一步确定缺血后CMPK2在小胶质细胞/巨噬细胞中的表达，作者通过磁珠分选分离小胶质细胞/巨噬细胞。观察到卒中后24 h，与假手术组相比，小胶质细胞/巨噬细胞中CMPK2的表达显著增加（图2E-F）。然后为了模拟在体的脑缺血模型，体外原代小鼠星形胶质细胞、小胶质细胞和皮层神经元中建立氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation, OGD）诱导的细胞死亡模型。与体内实验结果一致，在原代小鼠小胶质细胞中，CMPK2的表达呈时间依赖性显著升高，并在6 h达到峰值（图2G-H）。然而，在OGD条件下，原代神经元中CMPK2表达出现轻微上升，原代星形胶质细胞中CMPK2表达无明显变化（图2I-J）。总之，这些数据表明，在急性中风期，CMPK2在缺血性脑卒中组织中小胶质细胞/巨噬细胞中的表达显著增加。
图2 脑缺血后CMPK2主要在小胶质细胞/巨噬细胞中表达上调
3. 小胶质细胞/巨噬细胞CMPK2敲低对小鼠tMCAO模型缺血性脑损伤具有保护作用
根据先前文献，在CX3CR1Cre/ERT2小鼠的右侧皮层中显微注射小胶质细胞/巨噬细胞特异性AAV-CMPK2短发夹RNA或对照AAV，随后连续5天给予他莫昔芬（图3A）。随后检测mCherry标记的AAV转染效率，观察到mCherry主要在小胶质细胞/巨噬细胞中检测到（图3B）。免疫组化染色和Western blotting结果显示，AAV-shCMPK2 CX3CR1Cre/ERT2小鼠大脑皮层小胶质细胞/巨噬细胞中CMPK2表达明显下调（图3C-D）。在CX3CR1Cre/ERT2小鼠中验证CMPK2 shRNA特异性靶向小胶质细胞/巨噬细胞。作者建立了小鼠tMCAO模型，研究小胶质细胞CMPK2在缺血性脑损伤中的潜在作用。首先评估了局部脑血流量（rCBF）以排除脑血管淤血变化的可能性，并最终验证了AAV-shCon和AAV-shCMPK2 CX3CR1Cre/ERT2小鼠在基线、缺血期间或再灌注后的rCBF没有明显差异（图3E-F）。然后在缺血后，AAV-shCMPK2 CX3CR1Cre/ERT2小鼠通过2,3,5氯化三苯基四氮唑（TTC）染色显示出改善的缺血体积，并且在Longa测试中，与AAV-shCon CX3CR1Cre/ERT2小鼠相比，显著改善了短期神经功能预后（图3G-H）。此外，作者还发现与AAV-shCon CX3CR1Cre/ERT2小鼠相比，AAV-shCMPK2 CX3CR1Cre/ERT2小鼠缺血性脑卒中后的缺血体积更小，神经功能得到了改善（图3I-J）。基于上述发现，可得出结论，小胶质细胞/巨噬细胞特异性CMPK2敲低可改善小鼠tMCAO模型的缺血性损伤。
图3 小胶质细胞/巨噬细胞CMPK2沉默减少小鼠tMCAO模型的脑缺血体积并改善短期神经相关功能表型
4. 小胶质细胞/巨噬细胞CMPK2敲低改善了小鼠tMCAO模型的长期功能表现
长期脑卒中幸存者的预后和生活质量与缺血性脑卒中后运动功能的恢复相关。为了进一步研究CMPK2对缺血性脑卒中后长期功能结果的影响，作者对缺血性脑卒中后的AAV-shCon和AAV-shCMPK2 CX3CR1Cre/ERT2小鼠进行了纵向T2加权MRI扫描和一系列长期功能测试（图4A）。MRI扫描显示，在tMCAO后14天，AAV-shCon CX3CR1Cre/ERT2小鼠的缺血病灶明显扩大，而AAV-shCMPK2 CX3CR1Cre/ERT2小鼠的梗死体积明显减少（图4B-C）。此外，AAV-shCMPK2治疗显著改善了CX3CR1Cre/ERT2小鼠的长期功能缺陷，与对照相比在缺血后0、3、5、7、14、21和28天，改良神经严重程度评分（mNSS）显著降低，挂线试验评分显著增加，前肢错误百分比显著降低，转棒试验时间显著增加（图4D）。另外与对照相比，AAV-shCMPK2治疗显著提高了相对延迟阶段（28天）的存活比例（图4E）。这些结果表明，小胶质细胞/巨噬细胞中的CMPK2至少部分参与了缺血性脑卒中后的缺血性损伤和长期功能不良。
图4 在小鼠tMCAO模型中小胶质细胞/巨噬细胞CMPK2抑制减少脑梗死并改善长期功能
5. 小胶质细胞/巨噬细胞CMPK2敲低促进缺血小鼠脑内小胶质细胞分支，抑制Ox-mtDNA诱导的NLRP3炎症小体活化
小胶质细胞形态具有高度可塑性和高速变化以密切监测和调节神经元功能，以应对各种环境情况，特别是缺血性损伤。为了探索小胶质细胞对缺血性脑卒中保护作用的潜在机制，作者评估了小胶质细胞/巨噬细胞沉默CMPK2对小胶质细胞形态的影响。观察到，在缺血后3天，AAV-shCMPK2 CX3CR1Cre/ERT2小鼠的小胶质细胞形态比AAV-shCon的小鼠小胶质细胞形态分支更多更稳定（图5A）。尤其形态计量分析表明，与AAV-shCon处理相比，AAV-shCMPK2处理可以增加分支长度和数量（图5B）。因此，敲低CMPK2在体内和体外均不影响小胶质细胞的增殖，并且抑制了缺血损伤后小胶质细胞的过度激活。
作者随后探讨了小胶质细胞/巨噬细胞CMPK2沉默对Ox-mtDNA生物标志物8-OHdG的影响。免疫荧光结果显示，缺血后24和72 h，AAV-shCon CX3CR1Cre/ERT2小鼠小胶质细胞中8-OHdG水平显著升高，而AAV-shCMPK2 CX3CR1Cre/ERT2小鼠梗死周边去8-OHdG水平显著降低（图5C-F）。CMPK2介导的Ox-mtDNA可驱动NLRP3炎症小体活化，最终促进邻近细胞的失控性炎症和死亡。与假手术小鼠相比，AAV-shCon CX3CR1Cre/ERT2小鼠梗死周边区具有生物活性的N-GSDMD、cleaved caspase-1和IL-1β的蛋白表达明显上调，而AAV-shCMPK2治疗后，CX3CR1Cre/ERT2小鼠梗死周边区在缺血后3天的蛋白表达显著降低。基于上述结果得出结论：在缺血性脑卒中后，CMPK2可以通过促进mtDNA复制来刺激Ox-mtDNA的形成，进而触发小胶质细胞/巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活。
图5 小胶质细胞/巨噬细胞CMPK2抑制促进缺血小鼠脑内小胶质细胞分支破坏Ox-mtDNA诱导的NLRP3炎症小体活化
6. NDGA作为有效的CMPK2抑制剂在体外对Ox-mtDNA的形成和NLRP3炎症小体的激活具有强大的抑制作用
基于上述发现，作者提出CMPK2抑制剂可能作为缺血性脑卒中的有前途的药物治疗。作者从含有天然产物和FDA批准药物的化合物库中筛选化合物，发现NDGA是一个有效的CMPK2抑制剂，其半数抑制浓度为5.958 μM（图6A）。NDGA是一种植物木脂素，具有抗癌、抗氧化、抗炎和镇痛功效。此外，表面等离子共振（SPR）结果表明，NDGA与CMPK2蛋白之间存在强烈结合，解离常数值为0.6 μM（图6B）。因此，作者研究了NDGA是否可以调节小胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活，结果表明NDGA处理显著抑制了ATP刺激后LPS诱导的小胶质细胞中N-GSDMD、cleaved caspase-1和IL-1β向细胞上清中的释放（图6C）。随后作者在LPS+ATP或OGD诱导的小胶质细胞损伤模型中评估了NDGA对细胞死亡的影响，发现NDGA可以有效降低LDH释放（图6D-E）。以上结果显示，NDGA在体外能够抑制小胶质细胞焦亡。受启发作者继续研究NDGA的作用是否与CMPK2抑制有关。结果显示NDGA处理显著下调了LPS处理后小鼠原代小胶质细胞中D-loop、Cox-1和CYTB的表达（图6F）。EdU染色结果显示，NDGA处理显著降低了LPS刺激后新合成的mtDNA（图6G）。此外，通过8-OHdG免疫染色在LPS引发的小胶质细胞中检测ATP刺激后，NDGA处理可以抑制Ox-mtDNA的水平（图6H）。这些结果支持了NDGA主要通过抑制CMPK2来抑制NLRP3炎症小体激活的假设。
图6 CMPK2特异性抑制剂NDGA在体外抑制小胶质细胞中Ox-mtDNA的形成和NLRP3炎症小体的激活
7. CMPK2抑制剂NDGA对脑缺血小鼠具有较强的神经保护作用
作者通过TTC染色发现NDGA给药以剂量依赖形式改善了缺血体积，并显著降低了缺血攻击后的Longa测试中的神经学评分（图7A-C）。此外，NGDA治疗显著改善了tMCAO小鼠的长期功能表现，即mNSS测试中的评分显著降低，挂线测试中的评分上调，足错误中的前肢错误百分比下调，以及在缺血后0、3、5、7、14、21和28天的转棒测试中相当于对照组的时间增加（图7D）。此外，与溶剂组相比，NDGA给药促进了缺血后小鼠在相对延迟阶段（28天）的存活比例（图7E）。这些结果表明，NDGA能够改善缺血性脑卒中小鼠的缺血性损伤，改善其长期神经功能的表现。
图7 小鼠tMCAO模型中CMPK2抑制剂NDGA减少脑缺血体积并高山神经相关功能表型
研究总结
总的来说，本研究通过Cre重组依赖的AAV介导的小胶质细胞/巨噬细胞CMPK2敲低或NDGA的药理学干预通过抑制Ox-mtDNA诱导的NLRP3炎症小体活化减轻缺血性损伤，表明小胶质细胞CMPK2可能在缺血性脑卒中的病理过程中发挥至关重要的作用。
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