多细胞生物个体发育的本质是多种细胞谱系建立的过程，在这一过程中细胞面临着一系列的命运调控。细胞命运调控的错误会导致产生状态、功能、类型异常的细胞，这是多种重大疾病形成的重要原因。建立精准调控细胞命运的方法，是实现调控个体发育、生理、代谢和衰老等生命活动以及疾病治疗的基本途径。LIN28A是一种高度保守的RNA结合蛋白，在促进体细胞重编程和多能性状态转变过程中发挥重要作用。细胞质中的LIN28A抑制let-7 microRNA的成熟在过去被广泛研究，但很少有研究关注LIN28A在细胞核中的作用，LIN28A 是否可以通过其核仁相分离特性调节干细胞命运决定仍待研究。
2024年2月10日，浙江大学基础医学院干细胞与再生医学中心张进课题组和浙江大学基础医学院冯钰课题组合作，在Nature Communications（IF：16.6）上发表的题为“Dynamic nucleolar phase separation influenced by non-canonical function of LIN28A instructs pluripotent stem cell fate Decisions”的研究论文。该研究利用多种先进分子生物学实验，包括CRISPR/Cas9基因组编辑系统、OP-Puro标记、免疫荧光等，并加以重编程和RNA-seq分析，以ESC E14细胞系为研究对象，深入揭示了由非典型相分离介导的核仁重塑过程及干细胞命运重编程的分子机制。
张进课题组2021年在Protein & Cell发表的研究论文发现了LIN28A协同促进干细胞中的核糖体功能，随后在Nature Communications上报道了核糖体能够通过染色体重构调节小鼠状态。本文与前两篇研究论文密切相关，并进一步从核仁应激和相分离角度，对核仁参与调控多能干细胞的命运决定的机制做出了更加深入的阐释。首次发现LIN28A可以作为一个核仁完整性的标志蛋白，LIN28A的非经典相分离功能可以调控重编程，和帕金森症相关联的LIN28A IDR突变对核仁相变有重要作用。国自然热点的关联碰撞，这样具有逻辑性和创新性的课题，更能够受到审稿人的青睐。
https://www.nature.com/articles/s41467-024-45451-4
核仁中蛋白LIN28A能够发生相分离，并且对温度敏感
首先，研究人员构建了eGFP-LIN28A敲入和过表达的小鼠胚胎干细胞E14细胞系，发现无论是敲入组或过表达组，荧光标记的LIN28A皆显著在核仁聚集，且与DFC（FBL）和GC（NPM）共定位，流动性测试发现二者具有相似的流动性（图1 a-c）。这说明核仁中的LIN28A蛋白可以作为核仁的标志物。
同时，相分离受到各种情况的影响，相分离抑制剂HEX处理后，核仁中的LIN28A对处理敏感，凝集物在核仁中更加分散及不规则，单位面积内荧光强度显著减弱，而细胞质中的LIN28A则未受到影响（图1 d-g）。LIN28A相分离冷凝物在25℃中表达减少，42℃则趋于紧凑，也有就是说LIN28A相分离的发生对温度敏感。在体外，LIN28A在50 mM NaCl浓度下以及rRNA存在的情况下更容易发生相分离（图1 h-j）。
图1
rRNA对于维持LIN28A在核仁中的定位及相分离至关重要
LIN28A在rRNA存在的情况下更容易发生相分离，因此作者进一步研究了rRNA 是否在维持LIN28A在细胞核中的定位和相分离状态中发挥作用。研究发现，在rRNA抑制的三种情况下，核仁中LIN28A凝聚的位点数量和强度都有所减少，且分散面积扩大（图2 a-f）。在流动性方面，均表现出LIN28A的流动性降低，表明rRNA及其与LIN28A的相互作用可能受到影响（图2 b-c）。另外，所有的rRNA 抑制方式都不影响LIN28A的整体表达水平。总之，这些结果表明rRNA对于促进LIN28A相分离和维持其在核仁中的定位至关重要。
图2
LIN28A中RBD和IDR在核仁蛋白LLPS至关重要
LIN28A蛋白有五个主要结构域，作者研究了LIN28A单个区域对相分离的贡献，发现Lin28a敲除导致核仁被破坏，而过表达全长LIN28A可以挽救FBL形态异常，当LIN28A的IDR或RBD被截断时，将无法挽救FBL形态（图3 a-d）。同时，截短的LIN28A造成FBL和NCL较低的流动性（图3 e-f），删除任何IDR或RBD的结构域都会影响其相分离（图3 g-i）。也就是说，LIN28A的RNA结合结构域（RBD）和内在无序区（IDR）是核仁相分离所必需的。
图3
IDR区域的关键氨基酸对于 LIN28A 和核仁相分离至关重要
上述的实验证明了RNA结合结构域和内在无序区对LIN28A和核仁的相分离至关重要，RBD已经在LIN28A功能的背景下进行了深入研究，因此作者进一步将研究范围精确到到赋予IDR相分离特性所必需的关键氨基酸。
接下来，作者构建了模拟去磷酸化的 S120A和S200A双氨基酸突变的LIN28A突变体（Mut LIN28A），并将该突变体稳定表达于LIN28A敲除的E14细胞系，发现Mut LIN28A在核仁内的流动性减弱，并且导致核仁蛋白FBL流动性减弱；同样，单个氨基酸突变体LIN28A蛋白也表现出相同的趋势（图4 a-l）。
最近，在两个早发性帕金森病的病人中发现了功能丧失突变体R192G LIN28A。分析发现，R192G单突变的LIN28A蛋白表现出了与之前的突变体相近的结果（图4 b、d-h、k-l）。
作者进一步确认了LIN28A突变体对核仁破坏作用是由于其相分离特性减弱所致，融合外源的FUS IDR恢复了LIN28A突变体的形态和相分离能力（图4 b、d-f、h-i、k-l）。综上所述，IDR区域的关键氨基酸对于LIN28A相分离以及维持正常的核仁相分离是必需的。
图4
LIN28A的相分离特性是其在小鼠胚胎干细胞的引发多能性状态转换所必需的
与LIF/2i相比，FGF2/Activin A培养基培养的野生型mESCs表达较高的primed状态标志基因（Otx2、Fgf5和Lin28a），较低的naive状态标志基因（Klf4、Nanog和Esrrb）。而敲除LIN28A的mESCs，表现出naive状态标志基因的持续高水平表达，而过表达全长LIN28A则恢复了向primed状态转换的能力，过表达Mut LIN28A时则倾向于维持naive状态，这在S120A、S200A和R192G三个单氨基酸突变体LIN28A中同样被验证。与FUS IDR融合后则挽救了这一变化，使得ESC进入primed状态（图5 a-d）。以上结果表明，LIN28A维持的核仁相分离对小鼠胚胎干细胞从naive到primed的转化至关重要。
另外，在primed状态的野生型mESCs中，FBL形成了较大的典型的“环”结构，而LIN28A的缺失会导致FBL环状结构不明显，NPM形态异常。这种异常的FBL形态和核仁分层在naive到primed的转换过程中没有改善。以上结果说明从naive状态到primed状态的转换过程中，LIN28A帮助核仁正确分层，维持核仁正常相分离（图5 e-h）。
图5
LIN28A的相分离特性是其在成纤维细胞的重编程作用所必需的
LIN28A是一个重编程因子，对体细胞重编程至关重要。研究发现LIN28A IDR区单个氨基酸突变导致重编程效率降低，FUS IDR融合后的LIN28A突变体挽救了降低的重编程效率，证明LIN28A的相分离有利于重新编程（图6 a-b，图7 a-b）。
作者进一步鉴定了小鼠的MEF细胞和iPSC的核仁状态，发现形态和分层存在显著差异。在MEF细胞中，NPM呈不规则形状；而在iPSCs中，NPM呈圆形带小孔的“莲藕”结构，并与LIN28A共定位（图6 c-h）。而与NHDF 细胞相比，iPSC具有更高的蛋白质合成率（图7 e-i）。
综上所述，在小鼠体细胞重编程的研究背景下， IDR区域介导的LIN28A相分离对小鼠体细胞重编程过程中的核仁重塑至关重要，并关系着重编程的效率。重编程的过程也是核仁分层变得清晰的过程。
图6
图7
综上所述，该研究明确了LIN28A帮助完善核仁分层，这在小鼠胚胎干细胞从naive到primed多能性转化过程中起到促进作用；以及在重编程体系中LIN28A相分离对核仁重塑，进而促进重编程的作用，其中IDR在介导LIN28A相分离和维持核仁完整性方面扮演了重要角色。
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