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蛋白酶K Proteinase K

健康   科学   2023-06-01 07:15   上海  




蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解。从林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中纯化得到。蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力。咨询订购热线：400-021-8158





蛋白酶K应用

  • ◆ 基因诊断试剂盒

  • ◆ 基因组DNA提取试剂盒

  • ◆ RNA提取试剂盒中去除DNA和RNA制备中的核酸酶

  • ◆ 提取组织中非蛋白成份降解含有蛋白质的杂质-譬如DNA疫苗和肝素的制备

  • ◆ 制备脉冲电泳的染色体DNA

  • ◆ 蛋白质印迹


  • *  蛋白酶K的一般工作浓度50-100ug/ml


蛋白酶K指标


品名

蛋白酶 K / Proteinase K

来源

林伯氏白色念球菌（Tritirachium album limber）

外观

白色冻干粉

比活

>30U/mg蛋白

分子量

29,730

CAS No.

39450-01-6

EC No

3.4.21.14

活性单位定义

37℃、pH 7.5条件下，每分钟可水解底物酪蛋白生成1μmol酪氨酸的蛋白酶K的量，定义为一个单位（U）。

DNase残留

以λDNA为底物，37℃消化6小时以上，未检测到脱氧核糖核酸酶活性。

RNase残留

25℃消化16小时以上，未检测到核糖核酸酶活性。

失活方法

反应体系中加入PMSF或DFP抑制剂即可失活，65℃温育10-15min可部分失活

包装

100mg，1g，10g，1kg 大包装询价


蛋白酶K储存

干粉状态可在0~4℃条件下低温保藏。溶解后分装为适当体积，-20℃贮存。运输可在室温下进行。正确的贮存条件下，干粉状态的有效期可达一年。液体状态在-20℃有效期为半年。打开包装使用后，如果在2~8℃环境下放置超过一周时间，建议过滤除菌或增加稳定剂如0.5%叠氮化钠，防止微生物污染。

贮存和稀释缓冲液：50mM Tris-HCl缓冲液,2mM CaCl2 (pH 8.0)。
反应条件：反应缓冲液中37-56℃温育一小时


蛋白酶K实验数据

1. 酶活测定和稳定性试验

(1) 酶活测定

试剂准备

试剂 I - 底物：1%牛奶乳酪蛋白溶液。

1 g牛奶乳酪蛋白溶于50 ml 0.1 M磷酸钠盐溶液，pH 8.0，65-70 ℃水域孵育15 min搅拌溶解，自来水冷却，氢氧化钠调节pH 8.0，定容100 ml。
试剂 II - TCA溶液：0.1 M三氯乙酸，0.2 M乙酸钠，0.3 M乙酸，HCl调节pH 4.03，定容100ml。
试剂 III - 0.4 M碳酸钠溶液。
试剂 IV - 福林酚试剂：用水5倍稀释。
试剂 V - 酶稀释液：0.1 M磷酸钠盐溶液，pH 8.0。
试剂 VI - 酪氨酸溶液：1 μg/ml酪氨酸，0.2 M HCl溶解。

操作步骤

1．0.5 ml试剂I 37 ℃孵育10 min，加入0.5 ml酶液，混匀，37 ℃反应10 min；
2．加入1 ml试剂II终止反应，混匀，继续孵育30 min；
3．离心反应液；
4．取0.5 ml上清液，加入2.5 ml 试剂III，0.5 ml试剂IV，混匀后37 ℃孵育30 min；
5．660 nm 测定OD1；空白对照组：0.5 ml试剂V代替酶液，测定OD2；
6．0.5 ml试剂VI，2.5 ml 试剂III，0.5 ml试剂IV，混匀后37 ℃孵育30 min。660 nm 测定OD3；
空白对照组：0.5 ml 0.2 M HCI代替试剂VI，测值为OD4。

活力计算


公式说明：
2：反应液总体积（mL）；
0.5：酶液体积（mL）；
10：反应时间（min）；
df：稀释倍数；
181.2：酪氨酸分子量；
C：酶浓度( mg/mL)。


结果比较


蛋白酶K特异活性
制造商
国外M品牌
Seebio
冻干产品活性 u/mg
33.5
49.5


(2)纯度和消化蛋白测试（SDS-PAGE）

结果: 蛋白质纯度超过 99% （激光扫描 SDS-PAGE胶）


(3) 稳定性测试：

结论：冻干粉正确储存一年内活性不变；液体酶酶活半年内降低小于5%。


2. 对比试验

以Roche蛋白酶K和seebio蛋白酶K对比。

对比反应条件：roche蛋白酶k 65℃ 10m；Seebio 蛋白酶k 65℃ 10m；Seebio蛋白酶K 55℃ 60m

以下结果QC符合要求。每管均为500ul全血。共3组对照。

实验条件

得率
ROCHE65℃10m
33ug
19.2ug
5ug
SEEBIO65℃10m
30ug
20ug
4.8ug
SEEBIO55℃60m
30.4ug
18.5ug
5.4ug
全血提取DNA试剂盒电泳图
全血提取DNA actin电泳图
日期：2010.06.09
凝胶浓度：0.7％琼脂糖RNA胶
上样量：1ug/孔
电泳条件：U=105V T=15min
1. 090826-15（roche，65℃ 10m）
2. 090826-15（seebio，65℃ 10m）
3. 090826-15（seebio，55℃ 60m）
4. 090826-17（roche，65℃ 10m）
5. 090526-17（seebio，65℃ 10m）
6. 090826-17（seebio，55℃ 60m）
7. 090826-20（roche，65℃ 10m）
8. 090826-20（seebio，65℃ 10m）
9. 090826-20（seebio，55℃ 60m）
日期：2010.06.10
凝胶浓度：0.7％琼脂糖DNA胶
上样量：10ug/孔
电泳条件：U=95V T=15min
1. 090826-15（roche，65℃ 10m）
2. 090826-15（seebio，65℃ 10m）
3. 090826-15（seebio，55℃ 60m）
4. 090826-17（roche， 65℃ 10m）
5. 090526-17（seebio， 65℃ 10m）
6. 090826-17（seebio， 55℃ 60m）
7. 090826-20（roche， 65℃ 10m）
8. 090826-20（seebio， 65℃ 10m）
9. 090826-20（seebio， 55℃ 60m）
－：Negative control
＋：Positive Control

结论：SEEBIO 蛋白酶K与ROCHE蛋白酶k实验结果显示在65℃水浴10m后得率及跑胶图效果基本相同。可替代使用。


蛋白酶K产品列表

货号

品名

包装规格

EBY0027M

蛋白酶K(冻干，水溶）‍

100mg、1g

EBY0027J

蛋白酶K(冻干，甘油溶）

100mg、1g


蛋白酶K参考文献

1. Kraus, E; et.al. Proteinase K from the Mold Tritirachium album limber, Specificity and Mode of Action. Z. Physiol. Chem., 357:939; 1976.
2. Jany,KD, et al. Amino Acid Sequence of Proteinase K from the Mold, Tritirachium album limber. Proteinase K; a Subtilisin-related Enzyme with Disulfide Bonds. FEBS Letter, 199,139.1986.
3. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Volume 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, B.16.
4. Sweeney, P.J. and Walker, J.M. (1993) Enzymes of molecular biology. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 16, M.M. Burrell, ed., Humana Press, Inc., Totowa, NJ, 305.


西宝生物专业提供蛋白酶K Proteinase K（CAS:39450-01-6)。咨询订购热线：400-021-8158

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