CytoTRACE v2 在2024.03月发表在预印本Mapping single-cell developmental potential in health and disease with interpretable deep learning。V2 使用可解释性的AI算法来预测单细胞RNA测序数据的细胞分化潜能。除了给出从0（分化）到1（全能）的连续发育潜能度量结果外，还根据细胞的发育潜能进行分为6类：具有广泛分化潜能的全能(totipotent)和多能(pluripotent)干细胞，到能够产生不同数量的下游细胞类型的 谱系限制性多能细胞（lineage-restricted oligopotent），多能(multipotent)和单能(unipotent)细胞，再到最终的 分化（differentiated）细胞。
相较V1的功能和理论的改进详见文献正文，在代码实现上CytoTRACE v2中拆分为了R版本和Python版本，安装R版本的话无需配置python的环境，使用门槛大幅降低。
一 载入R包，数据
1，R包安装 及 解决报错
根据https://github.com/digitalcytometry/cytotrace2?tab=readme-ov-file中的方式进行安装
（1）使用devtools::install_github直接安装
devtools::install_github("digitalcytometry/cytotrace2", subdir = "cytotrace2_r")library(CytoTRACE2)# 出现报错Using github PAT from envvar GITHUB_TOKENDownloading GitHub repo digitalcytometry/cytotrace2Error in utils::download.file(url, path, method = method, quiet = quiet, :download from 'https://api.github.com/repos/digitalcytometry/cytotrace2/tarball/HEAD' failed
（2）如果出现上述的报错，这时候只要将报错内容的“https://api.github.com/repos/digitalcytometry/cytotrace2/tarball/HEAD” 复制到网址搜索栏回车，就会下载一个文件tar.gz的压缩文件，然后我们再本地安装即可。
# 本地安装remotes::install_local("./digitalcytometry-cytotrace2-6fe2bad.tar.gz",subdir = "cytotrace2_r", # 特殊的upgrade = F,dependencies = T)library(CytoTRACE2)library(tidyverse)library(Seurat)
注：打开tar.gz压缩包可以看到作者分的python 和r 版本，所以这里需要使用subdir参数指定为cytotrace2_r 。
注：其他的github包出现类型报错也可以使用上述方式进行解决，一般不需要设置subdir 。
2，准备单细胞数据
然后使用之前注释过的sce.anno.RData数据 ，为节省资源，每种细胞类型随机抽取30%的数据。
load("sce.anno.RData")sce2@meta.data$CB <- rownames(sce2@meta.data)sample_CB <- sce2@meta.data %>%group_by(celltype) %>%sample_frac(0.3)sce3 <- subset(sce2,CB %in% sample_CB$CB)sce3# An object of class Seurat
二 CytoTRACE v2 分析
1，CytoTRACE v2 分析
该版本可以接受单细胞对象 或者 单细胞矩阵的两种形式，物种可以是人或者小鼠（默认）。本推文是使用 人 的单细胞对象（sce3）进行cytotrace2分析的示例。
#######输入seurat 对象###########cytotrace2_result_sce <- cytotrace2(sce3,is_seurat = TRUE,slot_type = "counts",species = 'human',seed = 1234)cytotrace2_result_sceAn object of class Seurat51911 features across 4202 samples within 1 assayActive assay: RNA (51911 features, 2000 variable features)4 dimensional reductions calculated: pca, umap, tsne, harmony
输入的是单细胞对象，得到的也是单细胞对象，且meta信息中包含了相关score的结果。
其中CytoTRACE2_Relative为score的具体数值结果；CytoTRACE2_Potency为文章开头提到的的六类结果。
注1：cytotrace2默认的是小鼠，所以需要指定species = 'human' ；如果是单细胞对象的话需要指定is_seurat = TRUE ；指定seed 方便后续的结果复现。。
2，CytoTRACE v2可视化
（1）v2在 plotData
同cytotrace v1的可视化函数不一样，v2在 plotData函数中包装了一些常见的可视化结果 ，可以先设定待展示的表型（celltype） 。
# making an annotation dataframe that matches input requirements for plotData functionannotation <- data.frame(phenotype = sce3@meta.data$celltype) %>%colnames(sce3))# plottingplots <- plotData(cytotrace2_result = cytotrace2_result_sce,annotation = annotation,is_seurat = TRUE)# 绘制CytoTRACE2_Potency的umap图p1 <- plots$CytoTRACE2_UMAP# 绘制CytoTRACE2_Potency的umap图p2 <- plots$CytoTRACE2_Potency_UMAP# 绘制CytoTRACE2_Relative的umap图 ，v1p3 <- plots$CytoTRACE2_Relative_UMAP# 绘制各细胞类型CytoTRACE2_Score的箱线图p4 <- plots$CytoTRACE2_Boxplot_byPheno+ plot_layout(ncol = 2)
（2）调整出图的风格，与V1接近（plotData函数中的代码）
FeaturePlot(cytotrace2_result_sce, "CytoTRACE2_Relative",pt.size = 1.5) +scale_colour_gradientn(colours =(c("#9E0142", "#F46D43", "#FEE08B", "#E6F598","#66C2A5", "#5E4FA2")),na.value = "transparent",limits = c(0, 1),breaks = seq(0, 1, by = 0.2),labels = c("0.0 (More diff.)","0.2", "0.4", "0.6", "0.8", "1.0 (Less diff.)"),name = "Relative\norder \n",guide = guide_colorbar(frame.colour = "black",ticks.colour = "black")) +ggtitle("CytoTRACE 2") +xlab("UMAP1") + ylab("UMAP2") +theme(legend.text = element_text(size = 10),legend.title = element_text(size = 12),axis.text = element_text(size = 12),axis.title = element_text(size = 12),plot.title = element_text(size = 12,face = "bold", hjust = 0.5,margin = margin(b = 20))) +theme(aspect.ratio = 1)
单细胞的很多可视化都是可以使用ggplot2进行自定义的。更多ggplot2 的调整可以参考ggplot2 | 关于标题，坐标轴和图例的细节修改，你可能想了解,ggplot2|详解八大基本绘图要素,ggplot2|theme主题设置，详解绘图优化-“精雕细琢” 等 。
（3）细胞类型-箱线图
除了p4自带的箱线图，也可以根据需求自行绘制 scRNA分析|使用AddModuleScore 和 AUcell进行基因集打分，可视化
library(ggpubr)p1 <- ggboxplot(cytotrace2_result_sce@meta.data, x="celltype", y="CytoTRACE2_Score", width = 0.6,color = "black",#轮廓颜色fill="celltype",#填充palette = "npg",xlab = F, #不显示x轴的标签bxp.errorbar=T,#显示误差条bxp.errorbar.width=0.5, #误差条大小size=1, #箱型图边线的粗细outlier.shape=NA, #不显示outlierlegend = "right") #图例放右边###指定组比较my_comparisons <- list(c("Epi", "un"), c("T", "un"),c("Myeloid", "un"))p1+stat_compare_means(comparisons = my_comparisons,method = "wilcox.test")
3，结合monocle2 确定起点
相关的预测结果已经在metadata中了，可以在monocle2中绘制基于分化 score的结果，以此来帮助确定起点。
参考资料：
[1]Mapping single-cell developmental potential in health and disease with interpretable deep learning
[2]Single-cell transcriptional diversity is a hallmark of developmental potential
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精心整理（含图PLUS版）|R语言生信分析，可视化（R统计，ggplot2绘图，生信图形可视化汇总）
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