前面介绍过整合scRNA-seq和空间转录组数据主要有（1）映射（Mapping）和（2）去卷积（Deconvolution）两种方法。前面空转 | 结合scRNA完成空转spot注释（Seurat Mapping） & 彩蛋（封面的空转主图代码）介绍了使用Seurat Mapping的方式进行spot注释，本文介绍一种经典的解卷积方法-SPOTlight。
一 载入R包，数据
直接使用前面Seurat空转得到的空转和单细胞转录组的结果。
library(SPOTlight)library(Seurat)library(ggplot2)library(SingleCellExperiment)library(scater)library(scran)#load dataload("Brain_ST_scRNA.sBio.Rdata")head(Brain_scRNA)head(Brain_ST)
准备工作详见前面，单细胞数据最好完成了注释。
二 SPOTlight 分析
1，数据处理
先将数据转为SingleCellExperiment 对象，然后按照官网文档https://github.com/MarcElosua/SPOTlight/blob/HEAD/vignettes/SPOTlight_kidney.Rmd 进行处理
sce <- as.SingleCellExperiment(Brain_scRNA)### Feature selectionsce <- logNormCounts(sce)### Variance modelling# 去掉核糖体和线粒体基因genes <- !grepl(pattern = "^RP[L|S]|MT", x = rownames(sce))dec <- modelGeneVar(sce , subset.row = genes)# 计算高变基因hvg <- getTopHVGs(dec, n = 3000)# 加上细胞注释信息colLabels(sce) <- colData(sce)$celltype# Compute marker genesmgs <- scoreMarkers(sce, subset.row = genes)# 保留最相关的marker基因mgs_fil <- lapply(names(mgs), function(i) {x <- mgs[[i]]# Filter and keep relevant marker genes, those with AUC > 0.8x <- x[x$mean.AUC > 0.8, ]# Sort the genes from highest to lowest weightx <- x[order(x$mean.AUC, decreasing = TRUE), ]# Add gene and cluster id to the dataframex$gene <- rownames(x)x$cluster <- idata.frame(x)})mgs_df <- do.call(rbind, mgs_fil)
使用lapply函数批量得到每种celltype的marker 基因，这里是根据AUC的阈值（0.8）进行筛选，其中0.8 可以根据需要自行更改。
2，SPOTlight分析
使用SPOTlight主函数进行分析，注新版本的是SPOTlight函数，而不是spotlight_deconvolution函数了。
### Deconvolutionres <- SPOTlight(x = sce,y = Brain_ST,= as.character(sce$celltype), # 也可以是cluster，mgs = mgs_df,hvg = hvg,weight_id = "mean.AUC",= "cluster",gene_id = "gene")#Extract data from `SPOTlight`:decon_mtrx <- res$mat#这里重命名，非必要<- paste(colnames(decon_mtrx),"Spotlight",sep = "_")
结果得到的是每个spot的 各个celltype的占比，这里重命名是为了区分（比如后面使用其他方法进行注释）。
和Seurat一致，也可以2种保存方式
（1）添加至metadata.
（2）虽然res 不是SeuratObject ，但是也可以构建为新的slot 。
#meta 方式添加Brain_ST@meta.data <- cbind(Brain_ST@meta.data, decon_mtrx)head(Brain_ST)#构建新的 slotBrain_ST[["SPOTlight"]] <- CreateAssayObject(t(res$mat))DefaultAssay(Brain_ST) <- "SPOTlight"
三 SPOTlight 结果可视化
1，提取SPOTlight结果
## 提取结果head(mat <- res$mat)[, seq_len(length(unique(sce$celltype)))]mod <- res$NMFres.data <- (mat <- res$mat)[, seq_len(length(unique(sce$celltype)))]
2，topic对细胞类型的拟合情况
使用plotTopicProfiles 函数绘制拟合情况图
## 检查topic对细胞类型的拟合情况plotTopicProfiles(x = mod,y = sce$celltype, #facet = FALSE,min_prop = 0.01,ncol = 1) +theme(aspect.ratio = 1)
3，Correlation Matrix 和 Co-localization
## Spatial Correlation Matrixp1 <- plotCorrelationMatrix(mat)## Co-localizationp2 <- plotInteractions(mat, "heatmap")plotInteractions(mat, "network")
4，Scatterpie 饼图
这时SPOTlight 注释spot后的核心图，将每个spot中的各celltype比例绘制为饼图，可以绘制到切片tiff背景上（左图），也可以同样的形状绘制在白板上（右图）。
ct <- colnames(mat)< 0.1] <- 0#自定义颜色paletteMartin <- c("#004949", "#009292", "#ff6db6", "#ffb6db","#490092", "#006ddb", "#b66dff", "#6db6ff", "#b6dbff","#924900", "#db6d00", "#24ff24", "#ffff6d")pal <- colorRampPalette(paletteMartin)(length(ct))names(pal) <- ctp3 <- plotSpatialScatterpie(x = Brain_ST,y = mat,cell_types = colnames(mat),= T, #以tiff为背景scatterpie_alpha = 1,pie_scale = 0.4,# Rotate the image 90 degrees counterclockwisedegrees = -90,# Pivot the image on its x axisaxis = "h") +scale_fill_manual(values = pal,breaks = names(pal))p4 <- plotSpatialScatterpie(x = Brain_ST,y = mat,cell_types = colnames(mat),img = FALSE,scatterpie_alpha = 1,pie_scale = 0.4) +scale_fill_manual(values = pal,breaks = names(pal))p3 + p4
注意：（1）可以通过img 是否添加背景 ；
（2）pal 自定义颜色，注意长度 与celltype个数一致 ；
（3）degrees 调整翻转角度 和 tiff图片一致
5，批量绘制解析后的结果
前面Seurat的 四 彩蛋- 空转主图可视化 部分了介绍了lapply 得到list然后自定义拼图的方式，这里介绍一下SpatialFeaturePlot进行绘制的方式。
注意要用 & 而不是 + ，否则后续的theme等设置只会对最后一张图有效果。
celltypes = rownames(Brain_ST)SpatialFeaturePlot(Brain_ST, features = celltypes,pt.size.factor = 1.6,ncol = 4,crop = TRUE) &DarkTheme() &theme(text=element_text(size=14)) &theme(text=element_text(face = "bold")) &theme(legend.text=element_text(size=7))
https://github.com/satijalab/seurat/issues/3698 That is because of differences between patchwork and ggplot2. Simply use patchwork theming & instead of ggplot2 +.
参考资料：
https://github.com/MarcElosua/SPOTlight/blob/HEAD/vignettes/SPOTlight_kidney.Rmd
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精心整理（含图PLUS版）|R语言生信分析，可视化（R统计，ggplot2绘图，生信图形可视化汇总）
