在对单细胞数据进行注释后，通常会使用柱形图比较 不同分组 之间的cluster/celltype差异 scRNA分析|单细胞文献Fig1中的分组umap图和细胞比例柱形图，本文介绍张老师2021年发表于SCIENCE的Pan-cancer single-cell landscape of tumor-infiltrating T cells 文献中OR比值的方法（OR>1.5标示倾向在该分组中分布，OR<0.5标示不倾向在该分组中分布，详见文献methods），来比较不同分组（正常组织，肿瘤组织，PBMC，用药前后等）间cluster/celltype之间的分布差异 。该方法在越来越多的文献中出现。
一 载入R包，数据
1 ，载入必要的R包
#remotes::install_github("Japrin/sscVis")library("sscVis")library("data.table")library("grid")library("cowplot")library("ggrepel")library("readr")library("plyr")library("ggpubr")library("tidyverse")library(viridis)library(Seurat)library(pheatmap)
2，载入函数
这里使用24年NG文献Multi-omic profiling of clear cell renal cell carcinoma identifies metabolic reprogramming associated with disease progression中提供的OR分析的2个主函数
do.tissueDist <- function(cellInfo.tb = cellInfo.tb,meta.cluster = cellInfo.tb$meta.cluster,colname.patient = "patient",loc = cellInfo.tb$loc,out.prefix,pdf.width=3,pdf.height=5,verbose=0){##input datalibrary(data.table)dir.create(dirname(out.prefix),F,T)cellInfo.tb = data.table(cellInfo.tb)cellInfo.tb$meta.cluster = as.character(meta.cluster)if(is.factor(loc)){cellInfo.tb$loc = loc}else{cellInfo.tb$loc = as.factor(loc)}loc.avai.vec <- levels(cellInfo.tb[["loc"]])count.dist <- unclass(cellInfo.tb[,table(meta.cluster,loc)])[,loc.avai.vec]freq.dist <- sweep(count.dist,1,rowSums(count.dist),"/")freq.dist.bin <- floor(freq.dist * 100 / 10)print(freq.dist.bin){count.dist.melt.ext.tb <- test.dist.table(count.dist)p.dist.tb <- dcast(count.dist.melt.ext.tb,rid~cid,value.var="p.value")OR.dist.tb <- dcast(count.dist.melt.ext.tb,rid~cid,value.var="OR")OR.dist.mtx <- as.matrix(OR.dist.tb[,-1])rownames(OR.dist.mtx) <- OR.dist.tb[[1]]}sscVis::plotMatrix.simple(OR.dist.mtx,out.prefix=sprintf("%s.OR.dist",out.prefix),show.number=F,waterfall.row=T,par.warterfall = list(score.alpha = 2,do.norm=T),exp.name=expression(italic(OR)),z.hi=4,palatte=viridis::viridis(7),pdf.width = 4, pdf.height = pdf.height)if(verbose==1){return(list("count.dist.melt.ext.tb"=count.dist.melt.ext.tb,"p.dist.tb"=p.dist.tb,"OR.dist.tb"=OR.dist.tb,"OR.dist.mtx"=OR.dist.mtx))}else{return(OR.dist.mtx)}}test.dist.table <- function(count.dist,min.rowSum=0){count.dist <- count.dist[rowSums(count.dist)>=min.rowSum,,drop=F]sum.col <- colSums(count.dist)sum.row <- rowSums(count.dist)count.dist.tb <- as.data.frame(count.dist)setDT(count.dist.tb,keep.rownames=T)count.dist.melt.tb <- melt(count.dist.tb,id.vars="rn")colnames(count.dist.melt.tb) <- c("rid","cid","count")count.dist.melt.ext.tb <- as.data.table(ldply(seq_len(nrow(count.dist.melt.tb)), function(i){this.row <- count.dist.melt.tb$rid[i]this.col <- count.dist.melt.tb$cid[i]this.c <- count.dist.melt.tb$count[i]other.col.c <- sum.col[this.col]-this.cthis.m <- matrix(c(this.c,sum.row[this.row]-this.c,other.col.c,sum(sum.col)-sum.row[this.row]-other.col.c),ncol=2)res.test <- fisher.test(this.m)data.frame(rid=this.row,cid=this.col,p.value=res.test$p.value,OR=res.test$estimate)}))count.dist.melt.ext.tb <- merge(count.dist.melt.tb,count.dist.melt.ext.tb,by=c("rid","cid"))count.dist.melt.ext.tb[,adj.p.value:=p.adjust(p.value,"BH")]return(count.dist.melt.ext.tb)}
该分析只需要 分组信息 和 cluster/celltype结果 ，也就是meta.data 中的两列信息。
二 OR分析
1，载入单细胞数据
仍然使用之前的sce2数据，为减少计算量提取Myeloid亚群做示例 ，注意该分析 需要不同分组 的 cluster/celltype细胞数均不为 0。
load("sce.anno.RData")sce.Mye <- subset(sce2,celltype %in% c("Myeloid" ) )sce.Mye <- NormalizeData(sce.Mye)sce.Mye <- FindVariableFeatures(sce.Mye, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)sce.Mye <- ScaleData(sce.Mye)sce.Mye <- RunPCA(sce.Mye, npcs = 20)#标准流程，参数不变sce.Mye <- sce.Mye %>%RunUMAP(dims = 1:20) %>%FindNeighbors(dims = 1:20) %>%FindClusters(resolution = c(0.05, 0.1,0.2,0.4,0.5))DimPlot(sce.Mye, group.by = "RNA_snn_res.0.2",label = F)table(sce.Mye$group ,sce.Mye$RNA_snn_res.0.2)# 0 1 2 3 4 5# MET 9 4 10 162 156 7# PT 588 399 205 21 19 35
2，计算OR值
由于do.tissueDist函数限定了meta.cluster = cellInfo.tb$meta.cluster, loc = cellInfo.tb$loc, 为减少报错 建议修改我们输入矩阵的名字来适配函数 。
meta <- sce.Mye@meta.data# 修改名字meta$loc <- meta$groupmeta$meta.cluster <- meta$RNA_snn_res.0.2# 指定输出文件路径及前缀out.prefix <- "./Fig_OR"#主分析函数OR.immune.list <- do.tissueDist(cellInfo.tb=meta,out.prefix=sprintf("%s.Immune_cell",out.prefix),pdf.width=4,pdf.height=8,verbose=1)
结果存放在OR.immune.list的列表中，含有OR值 以及 对应的P值 ，提取对应的数据绘制可视化热图 。
这就完成了真实数据的OR分析，受限细胞数 和 分组，本图不是很美观。
3，使用文献panT数据（图更好看）
文献中的int.CD8.S35.meta.tb.rds就是meta.data矩阵文件，和上面的是一样的，只是问了颜值高一点。
meta <- read_rds("int.CD8.S35.meta.tb.rds")head(meta)OR.immune.list <- do.tissueDist(cellInfo.tb=meta,out.prefix=sprintf("%s.Immune_cell",out.prefix),pdf.width=4,pdf.height=8,verbose=1)
其中loc 和 meta.cluster均有 ，因此无需更改名字直接函数分析即可。
4，可视化
函数默认使用sscVis::plotMatrix.simple绘制，热图中没有P值的结果。前面提到结果存放在OR.immune.list 列表中，那么就可以分别提取OR结果 和 p值结果，然后使用pheatmap自定义绘制热图 或者 其他可视化形式。
# a 存OR值结果a=OR.immune.list[["OR.dist.tb"]]a <- as.data.frame(a)rownames(a) <- a$rida <- a[,-1]a <- na.omit(a)a
# b存P值结果b <- OR.immune.list$count.dist.melt.ext.tb[,c(1,2,6)]b <- spread(b,key = "cid", value = "adj.p.value")b <- data.frame(b[,-1],row.names = b$rid)b <- b[rownames(a),]b
将P值改为*的展示形式，绘制热图展示P值结果 。
考虑到OR值在文献中定义的0.5 和 1.5 值，这里设置bk参数。
col <- viridis(11,option = "D")b = ifelse(b >= 0.05&(a>1.5|a<0.5), "",ifelse(b<0.0001&(a>1.5|a<0.5),"****",ifelse(b<0.001&(a>1.5|a<0.5),"***",ifelse(b<0.01&(a>1.5|a<0.5),"**",ifelse(b < 0.05&(a>1.5|a<0.5),"*","")))))bk=c(seq(0,0.99,by=0.01),seq(1,2,by=0.01))pheatmap(a[,], border_color = "NA", fontsize = 9,cellheight = 12,cellwidth = 20,clustering_distance_rows="correlation",display_numbers = b,number_color="black",fontsize_number=10,cluster_col=F, cluster_rows=T, border= NULL, breaks=bk, treeheight_row = 20,treeheight_col = 20,color = c(colorRampPalette(colors = col[1:6])(length(bk)/2),colorRampPalette(colors = col[6:11])(length(bk)/2)))
OK，CNS或者大子刊文献的组间细胞类型比较 Get ！
参考资料：AndersonHu85/ccRCC_multiomics (github.com)
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