APackOfTheClones 是2021年的Single-cell analysis pinpoints distinct populations of cytotoxic CD4+ T cells and an IL-10+CD109+ TH2 cell population in nasal polyps文献中的一种克隆型计数分布的可视化方式。通过每个球对应于给定cluster中的一个克隆型，球的大小与celltype中该克隆的细胞数量成正比，且对应的位置与UMAP图近似。
一 载入R包，数据
首先下载，载入R包APackOfTheClones 。仍然使用前面免疫组库相关推文的数据，分别（1）使用Seurat的标准流程处理scRNA 和（2）使用 scRepertoire 的标准流程处理 scTCR 数据 （3）然后结合scRNA 和 scTCR的数据，详细的分析过程见 单细胞免疫组库VDJ| 从零开始scRepertoire分析，解决真实场景中可能的问题
#install.packages("APackOfTheClones")library(APackOfTheClones)library(Seurat)library(scRepertoire)library(tidyverse)library(ggsci) #获取期刊经典颜色library(scales) #展示颜色load("combined_seurat_T.RData")head(seurat_T,2)
二 scRepertoire可视化
使用常规方式在umap图中展示cloneType的信息
colorblind_vector <- colorRampPalette(rev(c("#0D0887FF", "#47039FFF","#7301A8FF", "#9C179EFF","#BD3786FF", "#D8576BFF","#ED7953FF","#FA9E3BFF","#FDC926FF", "#F0F921FF")))DimPlot(seurat_T, group.by = "cloneType",label = F) +scale_color_manual(values=colorblind_vector(5)) +theme(plot.title = element_blank())
前文提取出T细胞后，未做分析处理。这里为了后续的展示，先进行T细胞亚群的标准流程
sce.T <- NormalizeData(seurat_T)sce.T <- FindVariableFeatures(sce.T, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)sce.T <- ScaleData(sce.T)sce.T <- RunPCA(sce.T, npcs = 20)#标准流程，参数不变sce.T <- sce.T %>%RunUMAP(dims = 1:20) %>%FindNeighbors(dims = 1:20) %>%FindClusters(resolution = c(0.05, 0.1))DimPlot(sce.T, group.by = "RNA_snn_res.0.1",label = F)
T细胞的亚群注释，本推文重点不在注释，因此这里就根据meta的信息简单注释下 ，
Idents(sce.T) <- "RNA_snn_res.0.1"sce.T <- RenameIdents(sce.T,"0"="CD8A+ Exhausted","1"="CD4+ Naive","2"="CD8A+ Tissue-resident","3"= "CD8A+ NK-like","4"= "CD4+ Effector","5"= "CD8A+ NK-like","6"= "CD8A+ NK-like","7"= "CD4+ Activated IEG","8"= "CD8A+ Proliferating","9"= "CD8A+ NK-like" ,"10"="CD8A+ NK-like")sce.T@meta.data$celltype <- Idents(sce.T)DimPlot(sce.T, reduction = 'umap',label = T, pt.size = 0.5)
三 APackOfTheClones
通过以上过程得到了scTCR 和 scRNA数据结合在一起的sce.T文件，接下来使用APackOfTheClones进行可视化展示。通过各个cluster/celltype中圈的大小代表clone size的大小 。
3.1 默认参数
#不管用Idents(sce.T) <- "celltype"p0 <- vizAPOTC(sce.T, verbose = FALSE)p0
上述结果表明"CD8A+ Exhausted" 和 "CD8A+ NK-like" 细胞类型中clone 较多 。
可以看到即使设置了Idents 还是按照cluster 着色的，通过View(vizAPOTC) 查看函数也未发现可以调整的参数。
注1：后续根据猜测和测试验证，发现vizAPOTC函数会按照seurat_clusters列进行展示 ，暂时使用如下操作进行处理
# 备份原seurat_clusters结果sce.T$seurat_clusters2 <- sce.T$seurat_clusters# 将注释结果赋值给 seurat_clusterssce.T$seurat_clusters <- sce.T$celltype
3.2 图形美化
和期刊发表图相比，可以有以下几个地方可以进一步的调整 ：（1）标签Clone Sizes 的位置以及数值，（2）线型，大小 （3）按照细胞类型着色 。
# vizAPOTC 调整p1 <- vizAPOTC(sce.T,legend_sizes = c(1,10,50), # 指定Clone Sizes的数值add_legend_background = T , #是否添加灰色背景order_clones = TRUE, #legend_text_size = 3, #legend 标签大小legend_position = "top right" , #legend的位置 ，可以根据umap的方位进行调整try_place = T,res = 360L,linetype = "blank",use_default_theme = TRUE,retain_axis_scales = FALSE,show_labels = F, # 图中不展示标签label_size = 3, #verbose = FALSE)p1#调整颜色p11 <- p1 + scale_fill_nejm()p11
可以看到将注释结果celltype赋值给 seurat_clusters后，现在是按照细胞类型进行着色（也许有更好的方法）。
注2：scale_fill_nejm 颜色顺序和 seurat_clusters的factor顺序不一致 。
且#20854EFF的绿色莫名其妙的变成了legend的颜色。
注3：??vizAPOTC 的帮助页有很多的参数，这里只是展示了几个常用的，更多详细说明见官网。
3.3 调整scRNA umap颜色
上面的注2提到颜色顺序的问题，由于vizAPOTC函数包装的比较“严”，这里通过重新定义factor的顺序完成scRNA的颜色修改，使之与clone的颜色一致 。（也许有更好的方法）
（1）查看scale_fill_nejm的颜色
# 输出颜色编码pal_nejm("default")(8)#[1] "#BC3C29FF" "#0072B5FF" "#E18727FF" "#20854EFF" "#7876B1FF" "#6F99ADFF" "#FFDC91FF" "#EE4C97FF"# 展示颜色show_col(pal_nejm("default")(8))
（2）修改factor顺序指定颜色
结合vizAPOTC的颜色 和 nejm的颜色代码，重新定义levels 或者 对应修改cols的顺序，总之对应好即可。
Idents(sce.T) <- "seurat_clusters"sce.T$seurat_clusters <- factor(sce.T$seurat_clusters ,levels = c("CD4+ Effector" , "CD8A+ NK-like" ,"CD8A+ Tissue-resident" ,"CD4+ Activated IEG" ,"CD4+ Naive" ,"CD8A+ Exhausted" ,"CD8A+ Proliferating"))p2 <- DimPlot(sce.T, reduction = 'umap',cols = c("#BC3C29FF", "#0072B5FF" ,"#E18727FF","#7876B1FF" ,"#6F99ADFF", "#FFDC91FF","#EE4C97FF"),label = F, pt.size = 0.5 )p2
这样就完成了颜色的修改以及对应，可以放到文章中了。
参考资料
[1]https://qile0317.github.io/APackOfTheClones/articles/APackOfTheClones.html
[2]Single-cell analysis pinpoints distinct populations of cytotoxic CD4+ T cells and an IL-10+CD109+TH2��2cell population in nasal polyps
[3]Recombinant multimeric dog allergen prevents airway hyperresponsiveness in a model of asthma marked by vigorousTH2��2andTH17��17cell responses
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