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文丨Kevin
编丨Kevin
巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。
一、毕赤酵母生产过程
细胞增殖繁衍；
分批流加的过渡阶段（甘油或葡萄糖）；
诱导表达阶段（甲醇）；
各阶段碳源都为限制性基质，其补加速率的动力学模型是高效表达的基础。
毕赤酵母的优缺点
毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。
表达载体都是穿梭质粒，先在大肠杆菌复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞。为使产物分泌胞外，表达载体还需带有信号肽序列。
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优点
具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一；
表达效率高，其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90%以上，有利于目的蛋白的分离纯化；
在简单合成培养基中可实现高密度培养；
表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；
由于该酵母可以以甲醇为唯一碳源和能源，而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源，可以减少污染。
不足
发酵周期长；
甲醇易燃易爆有毒，存在一定的危险性；
筛选高产菌株需用的药物价格比较昂贵；
培养基和培养条件不成熟。
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三、毕赤酵母发酵的影响因素
一般来讲，比较重要的影响因素有葡萄糖浓度、温度、pH、溶解氧、氮源、营养盐和菌体自身的浓度。
1、温度
除个别特殊菌株外，绝大多数的酵母菌通常适宜在20-25°C条件下生长。此外，越高的温度对于避免杂菌污染来说越有利。
毕赤酵母的最适发酵温度为30°C，生长温度为25~30°C。工业上发酵一般都控制30~35°C范围内，在此范围内酵母正常生长繁殖。而一旦超过此温度范围，随着温度升高，酶很快失活，酵母细胞容易衰老，使发酵周期缩短，从而影响目的蛋白的表达。
2、pH
毕赤酵母细胞能够适应比较宽泛的pH环境，可以在pH2.0~7.5的环境中生长，对于蛋白种类的不同，适应的pH范围也不同，而且不同的蛋白对不同的蛋白酶的耐受性也有差异，选择适当的pH能够在促进细胞生长的同时避免蛋白酶的活性降低，防止目的蛋白的降解。
在工业生产中一般将pH控制在4.5~5.5之间，发酵过程中多采用在线补加氨水的方法来调节发酵液中的pH，同时氨水也可以作为发酵过程中的氮源，使菌体快速生长，最终让目的产物表达完全。
3、葡萄糖浓度
实验证明初始葡萄糖浓度在25g/L以上时菌体的得率会逐渐降低，这说明较高的葡萄糖浓度对菌体的生长有更大的抑制作用，在20g/L左右的初始葡萄糖浓度毕赤酵母生长的速率更高。
4、溶解氧
毕赤酵母是好氧微生物，它的生长代谢都需要氧气的参与，溶氧量是酵母细胞生长过程中最重要的检测指标之一。
DO保持在较低的水平明菌体正在消耗发酵液中的碳源，DO出现回升表明碳源耗尽，菌体整出于饥饿状态下，需要及时补加碳源。当氧气不足时，菌体的生长就会受到限制，当DO过高时，发酵液中高浓度的氧自由基就会使菌体中毒死亡。发酵过程中溶氧一般控制在30%，而在诱导阶段般维持在20%。
5、菌体浓度
通过改变不同初始酵母细胞浓度考察发酵性能，发现初始细胞浓度对毕赤酵母的发酵性能有显著影响。当初始细胞浓度较低时，细胞增长速率更快，蛋白表达较少;而当初始细胞浓度较高时，底物利用速率变慢、蛋白浓度和产率较高，因为酵母细胞利用底物去表达蛋白而不是进行细胞生长。
在甲醇诱导阶段，在进行诱导前尽量使菌体达到较大的浓度以适应甲醇环境，减轻中毒的情况。目前一般在湿重达到180~220g/L时停止补料进行甲醇诱导。
6、氮源
工业生产中，种子培养基中仍使用有机氮源如蛋白胨作为氮源，发酵过程中在调节pH值时，会补入大量氨水，这同时也为酵母细胞生长提供了氮源。
7、无机盐
毕赤酵母必须的营养盐有CaCl2、MgSO4、K2SO4、KH2PO4和K2HPO4等。微量元素如锌、钴、锰、钼、铜、铁等元素对于酵母细胞也是不可或缺的，它们有的是酶的辅助因子，有的是酶的激活剂。这些微量元素低浓度时对酵母的生长和产物的合成有促进作用，而高浓度时则会使酵母中毒，表现出抑制作用。
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来源：
[1] 李宇然. 以葡萄糖为碳源的毕赤酵母发酵工艺优化及诱导调控[D].河北大学,2018.
[2]https://baike.baidu.com/item/%E6%AF%95%E8%B5%A4%E9%85%B5%E6%AF%8D/9301649?fr=aladdin
[3] 邹小兵 乐国伟 张必武等. 影响毕赤酵母表达外源蛋白的因素.生物技术. 2002, 12(4) : 45- 46.
[4] Zhang W.Pichia pastoris fermentation with mixed- feeds of glycerol and methanol: growth kinetics and production improvement [J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2003, 30 (4) : 210 - 215.
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