基因合成：加速mRNA技术发展与应用
文摘
科学
2024-07-18 16:59
天津
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信使RNA（mRNA）通过转录从DNA中获取遗传信息，并在翻译过程中在核糖体上指导蛋白质的合成。理论上mRNA可以表达任何蛋白质，mRNA在基因编辑、疫苗开发、疾病治疗、细胞工程等方面具有巨大的潜力和应用前景。![]()
图1.中心法则
1961年，François Jacob和Jacques Monod首次提出并证实了mRNA的存在。1980-1990年代，合成mRNA技术取得重大进展。研究人员开发出体外转录系统（IVT），可以体外合成高质量的mRNA。因裸露的mRNA在体内极易被降解，有效的递送系统来保护和传递mRNA是mRNA疗法成功的关键。从早期的脂质体和阳离子脂质发展到现代的脂质纳米颗粒（LNPs）、聚合物纳米颗粒、外泌体和微针贴片，不断提高其稳定性、效率和安全性，使其在疫苗和基因治疗中的应用更加广泛和有效。2018年首个基于LNP递送的药物上市。2020年，因COVID-19，mRNA疫苗技术迅速成为焦点。全球首个商业化mRNA疫苗（mRNA-1273）上市。目前，各个领域的mRNA疫苗研究进展迅速，如针对呼吸道合胞病毒（RSV）mRNA疫苗和癌症的mRNA疫苗。今年5月和6月研究人员相继在《Science》《Nature》报道了癌症mRNA疫苗、HIV mRNA疫苗新突破[1][2]。研发生产周期短：设计和生产速度快，制备工艺简单，只需合成相应DNA序列，通过体外转录生产，易于规模化批量生产。灵活性和可调性：mRNA序列可以快速更换以应对病原体的变异，从而保持疫苗的有效性。
安全性高：mRNA疫苗不含病原体成分，且mRNA不进入细胞核，不整合到基因组中。但由于mRNA极易降解，需借助特殊载体送达体内，并且对运输和储存要求也非常严格。mRNA序列是由5个部分组成的单链RNA，从5ʹ到3ʹ分别为5ʹ帽结构（5ʹcap），5ʹ非翻译区（UTR ），编码抗原的开放阅读框（ORF），3ʹ非翻译区（UTR ）和多聚腺苷酸尾（Poly A尾）。![]()
图2.mRNA序列结构示意图
mRNA技术主要流程是从DNA到mRNA的转录过程，以及后续的修饰、纯化和应用步骤。以mRNA疫苗为例，主要流程分为以下步骤：
通过基因合成或传统载体构建方式将目标基因序列连接到带有RNA聚合酶启动子序列的载体中。使用限制性内切酶对连接成功且纯化好的质粒进行线性化，以作为体外转录过程的模板。如果需要共转录方式添加Poly(A)，则需先合成含有poly(A)尾序列的模板DNA，或者在体外转录后通过Poly(A)聚合酶添加Poly(A)。
加帽途径主要为2种，共转录加帽和转录后加帽。共转录加帽，一步纯化，容易放大，成本低，工艺稳定，加帽率较高。转录后加帽，加帽率接近100%，但加帽酶成本较高，且需两步纯化，难放大生产。
加尾途径主要为2种，通过基因合成直接在DNA序列末端添加poly(A)尾巴或者设计并合成包含长poly(A)尾巴序列的反向引物，然后使用PCR扩增成功将其加入到DNA模板的末端。通过基因合成直接添加poly(A)尾在模板序列中的方式，在高效性、精准性和高质量上具有显著优势。
mRNA疫苗的生产过程中，常采用模板直接引入poly(A)尾和共转录加帽，这样既能简化流程，又能保证mRNA的高效生成和一致性，适合大规模生产。使用重组RNA聚合酶（T7、T3或SP6）在体外合成mRNA，反应混合物包括线性化的DNA模板、核苷三磷酸（NTPs，包括修饰/未修饰的核苷酸）、适当的缓冲液、重组RNA聚合酶及帽子类似物（如果采用共转录加帽）。
体外转录完成后，使用DNase酶去除残留的DNA模板。经纯化去除反应混合物中的蛋白质、未反应的NTPs和其他杂质，得到mRNA原液。
包括定量分析（使用紫外分光光度计或荧光定量PCR）、纯度分析（如凝胶电泳或高效液相色谱）、以及生物活性测试（在细胞培养实验中验证翻译效率和功能）。
目前主要的递送系统采用脂质纳米颗粒（LNP）。通过微流控或射流等技术，将mRNA包裹在LNP中，形成稳定的纳米颗粒。这些LNP能够保护mRNA免受降解，并促进其有效地进入靶细胞，提高疫苗的输送效率和生物利用度。
mRNA技术为现代生物医学研究提供了重要工具和平台。未来，随着对mRNA技术的深入理解和技术的进一步革新，相信其在医学和生物技术领域的作用将会更加突出和广泛。擎科生物提供mRNA Poly(A)基因合成服务，能够合成长达120 bp的Poly(A)结构，为mRNA疫苗，mRNA疗法提供高效、精确的支持。
[1]Zhenfei Xie et al. mRNA-LNP HIV-1 trimer boosters elicit precursors to broad neutralizing antibodies.Science384,eadk0582(2024).[2]E Dolgin et al.How personalized cancer vaccines could keep tumours from coming back.Nature 630, 290-292 (2024)![]()
