2025年国自然还能写肿瘤免疫微环境吗？

一、背景介绍

我是小寻

二、论文简介

三、主要内容

1. 1.    单细胞转录组学鉴定IDH-WT-GBM中肿瘤组织和PBMC中的细胞类型

选取9个患者，对其肿瘤组织和PBMC制备单细胞悬液，采用Chromium Controller 和Chromium Single-Cell 3′ Reagent Kits对流式分选后获得的CD45⁺细胞构建单细胞文库，High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit和 Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit 对单细胞文库进行质控，Illumina NovaSeq 6000对文库进行测序，测序结果比对到参考基因组GRCh38上，经Cell Ranger V4.0生成基因表达矩阵（Fig.1A）。TSNE图展示出肿瘤组织和PBMC中所有检测到的免疫细胞（Fig.1B）,作者主要关注了4种骨髓来源的细胞，包括单核细胞（monocyte），巨噬细胞（macrophage），树突状细胞(DC)和肥大细胞；3种淋巴细胞，包括B细胞，NK细胞和T细胞（Fig.1C-D）。结果发现相比于PBMC，肿瘤组织浸润的免疫细胞中Macrophage和DC比例较高，而T cell, B cell和NK cell的比例较低（Fig.1E）。

Fig.1

1. 2.    单细胞转录组学分析IDH-WT-GBM中肿瘤组织和PBMC的髓样细胞异质性

接下来，作者重点关注了肿瘤组织中浸润较多的巨噬细胞（MDM）、小胶质细胞(MG)、DC和Monocyte的异质性，UAMP图展示了肿瘤组织和PBMC中的4个细胞亚群比例（Fig.2A）。Seurat工具包中的“AddMoudleScore”函数(一文搞定单细胞基因集评分)进行差异表达基因的功能富集分析，结果发现相比于PBMC中的髓样细胞，肿瘤组织中的Monocyte和    DC细胞中缺氧和干扰素应答信号通路明显上调，核糖体相关通路下调；MDM细胞中凋亡和免疫应答信号通路上调，核糖体相关通路也下调（Fig.2B）。进一步探究发现MDM和MG能够更细致地分为3个亚群（Fig.2C）,MDM的3个亚群分别高表达干扰素，抗原提呈和缺氧应答相关基因，MG的3个亚群分别高表达趋化因子，应激应答和干扰素相关基因（Fig.2D）。R package cluster Profiler对差异表达的基因进行富集分析，作者发现MDM-3和MG-1簇与炎症通路相关，MDM-3簇富集到缺氧相关通路，而MG-1高表达的趋化因子相关基因控制巨噬细胞迁移（Fig.2E）。

Fig.2

3. 肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAM）的基因特征和变化轨迹

为探究TAM细胞簇在肿瘤发生发展中究竟发挥了什么作用，作者评估了血管生成和吞噬作用的基因表达，发现MDM-3和MG-1中表现出较强的血管生成特征，而MDM-1和MG-3中表现出较高的吞噬作用特征（Fig.3A）。此外，作者检测两种细胞各个亚簇免疫检查点的表达（Fig.3B），发现不同的亚群对于不同的免疫检查点基因的表达不同。结合TCGA 和CGGA临床数据，通过GSVA 中的“gsva”函数(单细胞中应该如何做GSVA？)计算每个患者每个亚型的特征评分，survminer和survival进行生存分析，发现MDM-3或 MG-1高表达患者的总生存率低于低表达患者（Fig.3C-D）。然后，作者将带有聚类信息的 Seurat 对象转换为 SingleCellLaboratory 对象，使用“Slingshot”函数来推断细胞谱系和进行拟时分析（《拟时序分析》3.monocle2实操），发现MDM 的轨迹始于 MDM-1细胞，后通过MDM-2细胞转化为 MDM-3细胞，而MG细胞的轨迹从MG-3开始，后分化为 MG-1和 MG-2（Fig.3E-F）。

Fig.3

4. 肿瘤组织和PBMC中T细胞多样性

先前分析已经表明肿瘤组织和PBMC中T细胞的数目不同，因此作者对T细胞进行从头聚类分析来进探究其多样性，胶质瘤肿瘤组织和PBMC的T细胞分别聚类出7个亚群（Fig.4A）。两者共有4个亚群，各自特有3个亚群（Fig.4B）。为了进一步探究T细胞的功能，通过Seurat的“AddMoudleScore”函数计算不同T细胞亚群的功能分数，包括细胞毒性和耗竭等，发现CD8细胞毒性亚群的细胞毒性明显高于任何其他亚群，与以往研究一致，与PBMC相比，肿瘤组织中 CD8细胞毒性亚群的毒性较低，推测其可能与胶质瘤 TME 的免疫抑制作用有关，同时肿瘤组织中T细胞亚群的耗竭均高于PBMC（Fig.4C）。最后，对于两者共有的4个亚群进行差异基因的富集分析，发现肿瘤组织的T细胞亚群翻译相关通路下调，凋亡通路下调（Fig.4D）。

Fig.4

5. 肿瘤组织和PBMC中T细胞的发育

进一步使用“Slingshot”函数对T细胞进行拟时序分析，发现肿瘤组织的T细胞从CD8毒性T细胞逐渐转化为CD8耗竭T细胞和CD8应激T细胞（Fig.5A）,伴随着细胞毒性基因的下调和耗竭基因或应激基因的上调（Fig.5B-C）；AHR 是一种配体激活的转录因子（SCENIC单细胞转录因子预测学习手册），AHR激活可导致CD8T 细胞中抑制性受体的上调和细胞因子表达下调，分析发现，相比于PBMC，胶质瘤中 CD8细胞毒性亚群中AHR 的表达显著增加（Fig.5D），以上原因很有可能就是胶质瘤中TME免疫抑制的罪魁祸首。为了进一步探究AHR与T细胞肿瘤杀伤能力之间的关系，作者使用CRISPR-cas9技术通过转染SgAHR构建AHR敲除的EGFR CAR-T细胞，体外与表达EGFR的胶质瘤GSC3565细胞进行共培养，结果显示相比于敲除前，AHR缺失的T细胞耗竭变少，且具有更明显的IFN-γ分泌能力和肿瘤杀伤作用（Fig.5E-K）。RNA-seq测序结果显示，AHR缺失后细胞因子分泌相关基因明显上调（Fig.5L）。接下来，作者评估了胶质瘤小鼠中AHR缺失与否的CAR-T细胞抑制肿瘤的能力，结果显示AHR-KO CAR T细胞组小鼠T细胞耗竭减少且抑制肿瘤生长作用更明显，生存率更高（Fig.5M-P）。作者在体内体外均进行了实验，严谨地告诉我们AHR可能是优化 CAR-T 细胞治疗胶质瘤患者的潜在靶点。

 Fig.5

6. 胶质瘤肿瘤微环境中细胞间存在相互作用

肿瘤中微环境中细胞之间会不会存在通讯呢，作者进一步进行了探究，使用CellPhoneDB软件分析 L（配体）-R（受体）相互作用，发现相比于PBMC,胶质瘤TME中的细胞存在更多的相互作用（Fig.6A-B）。同时，作者更深一步地检测了CD8毒性T细胞间的细胞通讯，发现胶质瘤TME 中一些已知的负调节因子如配体骨桥蛋白(SPP1)及其受体 CD44和整合素亚单位 α4(ITGA4)介导的髓样细胞与 CD8毒性T细胞存在强相互作用（Fig.6C），TCGA 和CGGA数据库中SPP1和 CD44或 ITGA4 高表达的患者预后更差（Fig.6D）。Treg作为免疫调节细胞在肿瘤逃逸中发挥非常重要的作用，作者发现主要组织相容性复合体I 类和HLA-E，β2-微球蛋白(B2M)和受体杀伤细胞凝集素样受体 C1(KLRC1)介导的Treg亚群与CD8毒性T细胞间存在强相互作用，而这些亚群均是T细胞的负调节因子（Fig.6E）,B2M和KLRC1高表达的患者临床预后也更差（Fig.6F）。此外，作者还发现配体 C-C 基序趋化因子配体3(CCL3)和受体 C-C 基序趋化因子受体5(CCR5)相关的 Treg-MDM与小胶质细胞之间存在特异性相互作用（Fig.6G）,而CCL3和 CCR5的高表达也与较差的总生存率相关（Fig.6H）。以上结果告诉我们，抑制细胞间通讯也有可能是潜在的胶质瘤治疗靶点。

Fig.6

四、总结讨论

我是小寻