冠状病毒（CoV）是一种有包膜的、正义的、单链RNA病毒，广泛分布于人类、其他哺乳动物和鸟类中，可引起呼吸道、肠道、肝脏和神经系统疾病。冠状病毒属于巢病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）和正冠状病毒亚科（Orthocoronavirinae）。根据基因组分析，正冠状病毒亚科进一步分为四个属：α冠状病毒属（α-CoV）、β冠状病毒属（β-CoV）、γ冠状病毒属（γ-CoV）和δ冠状病毒属（δ-CoV）。迄今为止，已鉴定出7种人冠状病毒（HCoV），分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV-2。除HCoV外，猪肠致病性冠状病毒，包括传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和新出现的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)，是仔猪腹泻的主要致病原因，给猪肉行业带来了巨大的经济损失。最近，报道了一起人感染PDCoV的病例，该病毒是从急性发热性疾病患儿的血浆样本中分离出来的。冠状病毒相关流行病的出现和复发以及冠状病毒跨物种传播的证据越来越多，已成为全球公共卫生最严重的威胁。
CoV的保守非结构蛋白nsp5（胰凝乳蛋白酶样主蛋白酶，3CLpro；也称为主蛋白酶，Mpro）主要负责将orf1a和orf1ab水解为15-16个成熟的非结构蛋白，用于病毒复制和转录。此外，3CLpro可以通过水解参与先天免疫反应的宿主因子来减弱即时的抗病毒免疫反应，包括宿主信号转导和转录激活因子2(STAT2)和NF-κB必需调节剂(NEMO)。这些关键功能使3CLpro成为设计抗CoV疗法的有吸引力的靶标。CoV 3CLpro抑制剂模拟肽底物中3CLpro与P4-P1'位点（P和P'分别表示易断裂键前后的残基）之间的相互作用，以获得抑制效力和特异性。CoV 3CLpro底物结合模式的轻微改变可能会影响抑制剂结合，而不会影响肽底物相互作用。然而，CoV 3CLpro底物特异性多样性背后的分子机制尚未阐明，这阻碍了属特异性和广谱抑制剂的设计和优化。
进化可以通过将现有的生物物理特征整合到更高级架构中的基本遗传机制产生新的复杂分子结构和功能。对SARS-CoV-2的nsp5和刺突基因的此类研究为了解SARS-CoV-2的进化选择压力提供了有价值的见解。然而，受从一维核苷酸或氨基酸序列推断的系统发育树的限制，正冠状病毒亚家族内不同属之间的进化关系尚未得到广泛研究。因此，对各种CoV 3CLpros的结构和功能进行全面研究代表了一个有希望的前景，可以阐明四个不同属中CoV的进化过程，并促进抗病毒抑制剂的设计。
在本研究中，选择了来自四个CoV属的六个代表性3CLpros来表征底物结合模式。发现CoV 3CLpro具有属特异性的S2口袋和底物选择性。来自四个CoV属的古代3CLpros的祖先序列重建支持S2口袋的属特异性分化。八种新描述的3CLpros表现出多样化的S2口袋，可能代表现代3CLpro的祖先状态。此外，S2口袋主要有助于PF-07321332对不同CoV 3CLpros的属特异性抑制效力。作者对3CLpro底物特异性的分子机制的深入研究可用于指导CoV的进化过程并制定优化属特异性和广谱抑制剂的策略。
