猴痘病毒是一种直径可达350 nm的巨型囊膜病毒。它拥有近200 kbp的双链DNA基因组，编码了180余种蛋白质，相较于其他病毒而言组分构成极其复杂且体型庞大。加之其高致病性及传染性特征，至今尚无完整、真实猴痘病毒粒子的冷冻电镜照片或结构公开。因此，该研究团队在中国疾病预防控制中心BSL-3实验室内分离培养猴痘病毒并充分灭活。灭活样品经多轮验证并确认完全失去感染性后，被密封运送至清华大学BSL-2实验室进行实验。为了在保留真实病毒形貌的同时克服成像衬度、样品丰度等方面的挑战，研究团队优化调整了病毒粒子的提纯方案，得到高纯度、高丰度、高分散性、无感染性但又保留了完整病毒形态的猴痘病毒粒子样品。团队首先对中国大陆首个输入性病例的猴痘病毒毒株（clade IIb B.1）进行了冷冻电子断层成像（cryo-ET），发现大部分病毒粒子呈“圆饼”状，其长轴和短轴长度约为310 nm和270 nm。病毒的基因组被包裹在一个完整的、形似红细胞的两面凹内核中，内核壁由外层的栅栏状蛋白和下方的内壁蛋白组成；在内核的两侧各有一个含大量蛋白的侧体，侧体和内核一起被包裹在一层囊膜内，囊膜表面覆有密集的病毒刺突蛋白。
猴痘病毒成熟病毒粒子的冷冻电子断层图像（正面及侧面）
随后，作者通过子断层平均（sub-tomogram averaging）方法，团队解析了这些常规形态病毒粒子内核上栅栏蛋白的原位结构（i）。该结构在整体上与Alphafold2预测的A10三聚体拟合良好，但局部体现出一定的差异性。首先，其顶部横截面处可见每个A10单体亚基侧面均存在一未知的多余密度与相邻亚基相连。其次其中心横截面处未呈现出预测的连接密度。前人研究已发现该连接密度在痘苗病毒（VACV）的栅栏蛋白中真实存在。结合猴痘病毒与痘苗病毒的序列比较，推测该结构差异可能与猴痘病毒在两亚基相互作用界面上携带的氨基酸突变导致的电荷变化有关。
通过分析栅栏蛋白的组装规律，研究团队发现它们可灵活地排布成单元间距约为9 nm的蜂巢状结构（ii）。在内核上，团队也发现了花朵状的孔道复合体（iii）。这些孔道复合物由六个栅栏蛋白围绕一个孔道复合物构成，并局部扰乱周边栅栏蛋白的蜂巢状排列模式。这些看似随机分布的花朵状孔道复合物可能与病毒早期转录阶段的物质进出有关。
基于解析得到的蛋白结构和分布，团队将一颗代表性猴痘成熟病毒粒子进行重构，得到病毒分子构造模型。该模型在分子层面展示了真实猴痘成熟病毒粒子的结构和组装规律。
代表性猴痘病毒成熟病毒粒子的分子构造模型
然而，以上所示的常规形态猴痘病毒仅占据全部病毒粒子约60%的比例，其余近40%病毒粒子则与以往报道的正痘病毒形态不同，其内核壁折叠成扁平囊状、卷曲层状或形成多个独立的小核，病毒内部的内核构造并不似红细胞一样闭合且双面凹陷。
异常形态猴痘病毒粒子的电子断层图像与内核壁折叠模式
为了判断异常形态病毒是否广泛存在，研究团队又对C.1毒株进行了同样的观测。这一毒株分离自中国大陆首例本土传播病例，其出现晚于B.1毒株，自2023年中逐渐成为主要流行毒株之一。研究团队发现，尽管C.1毒株也存在类似的异常形态颗粒，其出现率却显著低于B.1毒株。这表明该毒株的内核组装成功率显著提升，一定程度上反映出伴随着2022-2023年的流行传播，clade IIb猴痘病毒可能发生了适应性进化并逐渐形成了更加高效的内核组装机制。
C.1毒株中异常形态猴痘病毒粒子出现率显著低于B.1毒株
综上所述，本研究通过揭示真实猴痘病毒的分子构造，发现2022年至今主要流行的两个代表性毒株存在不同比例的异常形态病毒粒子，提示猴痘病毒在内核组装方面可能发生了适应性进化。然而其他猴痘病毒分支与毒株，特别是2024年8月爆发的clade Ib分支毒株是否存在类似特征，这些异形病毒颗粒的形成机制，及这些毒株的形态是否和致病性存在关联等问题还有待进一步探索。此外，本研究主要揭示了猴痘病毒内核表面的分子构造，但更多结构细节，如内核中基因组如何组装、囊膜表面刺突蛋白的结构和分布规律，猴痘主要抗原与受体、中和抗体的结合机制等是下一步的研究重点。
