B组柯萨奇病毒（CVB）是病毒性心肌炎、脑膜炎和胰腺炎等严重疾病的主要致病病原体。由于对CVB的发病机制尚不清晰，目前仍缺少有效的抗病毒治疗措施。泛素化是蛋白翻译后修饰最普遍的形式之一，几乎涉及到所有的细胞进程。由于泛素化的普遍性和重要性，许多病毒进化出独特的机制来干扰宿主泛素化依赖的信号传导或利用泛素化来逃避先天免疫继继而促进病毒感染。有研究报道显示，CVB可利用宿主泛素化促进复制，但相关机制仍未被完全阐明。
近日，哈尔滨医科大学赵文然教授联合钟照华教授课题组发现E3泛素连接酶TRIM56可以介导CVB3 3D蛋白的泛素化和蛋白酶体降解，提示TRIM56是抗CVB感染的内在细胞因子，有望作为控制CVB感染的潜在策略。相关结果以题为"TRIM56 restricts Coxsackievirus B infection by mediating the ubiquitination of viral RNA dependent RNA polymerase 3D"在线发表于国际高水平期刊 《PLOS PATHOGENS》。
在本研究中，作者首先通过Western blot实验对CVB3 3D蛋白是否被泛素化修饰进行验证。值得注意的是，在CVB翻译的过程中会产生数个前体蛋白如3AB、3BCD，3ABC（Fig.1A）。因此，可被3D抗体检测的除了3D蛋白自身外也包括这些前体蛋白。这意味着Western blot 呈现的高分子量的3D蛋白不一定是被泛素化修饰的3D蛋白。为了确定3D蛋白的泛素化情况，作者使用CVB感染HeLa细胞后12h时候进行检测。发现大量大于58kDa（3D单体分子量）的蛋白，这些蛋白可能为泛素化的3D蛋白或是含有3D的病毒前体蛋白（Fig.1B）。为了排除前体蛋白的干扰，作者进一步使用3C抗体进行检测，发现可检测到72~100kDa范围的条带，这表明该范围内可同时被3C和3D抗体检测的蛋白是由3D和3C共同组成的前体蛋白（如3CD，3BCD以及3ABCD）。该结果同时表明，高于180kDa的蛋白不含有3C。进一步的变性co-ip实验发现，3D可以与泛素链连接，继而以高分子量（大于180kDa）形式存在，而3C蛋白则不会发生泛素化修饰，以上结果证明泛素化修饰仅发生在3D蛋白，而不是包含3D的前体蛋白。
Fig 1. The RNApolymerase 3D of CVB3 is polyubiquitinated.
随后，作者对CVB 3D蛋白连接的泛素链的类型进行检测，发现3D受到k48相关的多泛素化和蛋白酶体降解。为了确定3D蛋白中与泛素链连接的残基，作者构建了四个切断的3D蛋白质粒（ 1–83, 84–187, 188–340, 和 341–462），通过对不同截短3D的分子量进行检测发现泛素化修饰发生在 3D 的188-340区域内的K220残基上（Fig 2）。
Fig 2. CVB3 3D is polyubiquitinated at K220.
在确定CVB3的3D泛素化后，作者对负责3D泛素化的E3连接酶进行检测。通过提取感染CVB的HeLa细胞的总蛋白进行质谱分析，发现TRIM56在感染CVB3的细胞中显著增加，而大多数TRIMs保持不变 （Fig 4A）。随后，为了验证质谱的数据，作者又分别在感染CVB的细胞和小鼠中检测TRIM56的mRNA和蛋白表达水平，结果显示TRIM56 mRNA和蛋白水平显著升高（Fig 4B-K）。
Fig 3. E3 ligase TRIM56 is up-regulated in response to CVB3 infection
co-ip和激光共聚焦实验则进一步表明3D与TRIM56存在相互作用和共定位，且TRIM56可促进3D降解(Fig 4)。
Fig 4.TRIM56 colocalizes with the 3D protein of CVB3
最后，作者对CVB3是如何克服TRIM56的限制进行了探究。由于小RNA病毒的蛋白酶会降解细胞蛋白来对抗宿主的抗病毒防御，因此，作者假设TRIM56也可能被CVB3自身的蛋白酶切割。在排除caspase对TRIM56的切割后，作者通过一系列的酶切实验最终确定CVB的3C蛋白酶可以与TRIM56相互作用并负责对TRIM56进行切割（Fig 5）。
Fig 5. TRIM56is cleaved by the 3C protease of CVB3.
总的来说，本研究表明TRIM56是抗CVB感染的细胞限制因子，而促进病毒蛋白降解可能是控制CVB感染的潜在策略。
本文链接：https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1012594
本期编辑：小黄
