研究背景    

谷子是一种重要的粮食作物，也是一种新兴的模式植物。抽穗期(或开花时间)是决定植物区域适应性和制种产量的重要因素。谷子起源于中国北方温带地区，进一步改良使其在广泛的地理区域种植。它是一种短日照( SD )植株植物，光周期开花是其纬向适应性的关键决定因素。光周期敏感性是成花转变的关键因素，受内源生物钟组分和环境因子之间的相互作用控制，而环境因子在不同地理纬度之间存在差异。一些研究已经探索了谷子抽穗期的遗传机制。SiPHYC在LD条件下抑制开花，在SD条件下促进开花，表明谷子光周期开花存在明显的可逆调控机制。阐明光周期开花的分子机制将为提高作物产量提供机会，特别是在广泛的纬度范围内生长的作物。

文章介绍

2024年12月18日，中国农业科学院作物科学研究所刁现民研究员团队在《The Crop Journal》在线发表了题为“SiPRR37 exerts dual functions in the regulation of photoperiodic flowering and contributes to the ecological adaption of foxtail millet”的研究论文，作者通过全基因组关联分析鉴定到一个调控开花的关键基因SiPRR37，证明了其在不同光周期条件下开花调控的双向功能，明确了其自然变异的选择方式。

主要研究内容

为了鉴定控制抽穗期的遗传位点，本研究利用已发表的680份不同栽培谷子群体，在14个环境下对抽穗期进行了GWAS 。作者在2号染色体末端检测到一个稳定的基因组区域，在8个环境中与抽穗期显著相关 。作者将这个共同的QTL区域称为Hd2(图1A )。在连锁不平衡块分析中，Hd2被缩小到一个116 kb的基因组区域，包含21个注释基因(图1A )。其中一个基因Seita.2G444300编码一个与PRR3 / 7 同源的蛋白，在多种植物中调控光周期开花。最近的研究表明，Seita.2G444300是一个与抽穗期相关的Chr2上的强候选基因。因此，作者将Seita.2G444300，以下简称SiPRR37，作为Hd2位点的强候选基因进行重点研究。    

为了验证SiPRR37是否是控制抽穗期的候选基因，作者构建了35S：：SiPRR37 - GFP过表达载体，并将其转化到谷子品种Ci846中。在北京( 5月17日- 7月14日)、中国( 40 ° 10 N , 116 ° 14 E)的NLD条件下，两个独立的转基因株系分别比WT植株(图。1B、C)晚开花4.6和4.0 d。此外，在北京(图1D、E)的NSD条件( 8月3日- 9月6日)下，2个转基因株系的抽穗期较WT分别显著延迟2.6和2.5 d。这些结果证实Si PRR37是控制Chr2上主效抽穗期QTL的基因。

图1：控制抽穗期的Hd2位点下SiPRR37的鉴定

为了进一步验证SiPRR37的双功能，作者评估了在北京自然光周期条件下5月20日、6月22日和7月20日种植的Siprr37突变体和野生型植株的表型。5月、6月和7月播种的材料从出苗到抽穗的平均天数分别为14.9 h、14.7 h和13.9 h。表型分析表明，SiPRR37在5月播种和6月播种条件下延迟抽穗，但在7月播种条件下促进开花(图2 )。这些发现暗示Si PRR37的功能存在一个转换的临界日长( critical day length，CDL )。    

因此，作者进一步研究了Siprr37突变体和野生型植株在中国5个不同纬度地区的抽穗期：黑河( 50 ° 15N , 127 ° 30E)、哈尔滨(北纬45 ° 33 ,东经126 ° 57)、北京( 40 ° 10 N , 116 ° 19 E)、安阳( 36 ° 07N , 114 ° 21E)和三亚( 18 ° 24 N , 109 ° 45 E)；这些区域从出苗到抽穗的平均天数分别为16.1 h、15.6 h、14.6 h、14.3 h和11.2 h (图3F )。CRISPR / Cas9诱导的Siprr37突变体在黑河、哈尔滨和北京(图3A - C)表现出早花表型，但在三亚表现出晚花表型(图3E )。但在安阳点，突变体的抽穗期与WT无显著差异(图3D )。结合前述结果，我们推断在14.3 h左右存在一个CDL。

图2：CRISPR / Cas9诱导的Siprr37突变体在北京地区自然光周期条件下的表型    

图3：CRISPR / Cas9诱导的Siprr37突变体在中国各地自然光周期条件下的表型

为了进一步探究SiPRR37的功能意义，作者分析了SiPRR37基因组区域在680个栽培谷子群体中的自然变异情况。在SiPRR37基因的第1内含子中发现了48个SNPs和一个4.9 kb的属于Tc1 - Mariner转座子家族的片段indel (图4A )。这些变异定义了5种单倍型：Hap 1和Hap 2等位基因是主要的单倍型，而Hap 3、Hap 4和Hap 5发生在相对较低的频率(图4A)。与Hap 2相比，以转座子插入为特征的Hap 1导致SiPRR37的转录水平显著降低。Si PRR37的这一大片段插入缺失等位基因很可能是导致抽穗期的原因变异，因此作者重点关注Hap 1和Hap 2这两个主要的单倍型。之后进一步检测了跨越18 ° 24 N (三亚)至47 ° 21 N (齐齐哈尔)纬度的中国8个田间点的680组数据中主要单倍型( Hap 1和Hap 2)与抽穗期的关联。在纬度高于40 ° N的(齐齐哈尔、朝阳、北京)地区，除2011年朝阳外，携带Hap 1的材料开花显著早于携带Hap 2的材料；而在纬度低于36 ° N的(定西和三亚)地区，携带Hap 1的材料开花显著晚于携带Hap 2的材料(图4B )。此外，在36 ° N-40 ° N (榆林、太原、长治、安阳) (图4B )纬度范围内，抽穗期在不同年份和地点之间的差异更大，表明SiPRR37对这些纬度地区的抽穗期影响很小或仅有微小影响。这些发现证实了Si PRR37的自然变异体在自然光周期条件下具有调控开花的双重功能。    

基于自然变异在田间条件下的双重功能，作者进一步研究了680个栽培品种中主要单倍型的纬度分布。结果显示，Hap 2的频率从36 ° N以下纬度的54.89 %下降到45 ° N以上纬度的30.30 %，同时伴随着Hap 1的频率增加(图4C )。随着Hap 2的消失，Hap 1从低纬度到高纬度逐渐增加，表明这些等位基因受到了人工选择。在作者之前的研究中，根据邻接系统发育树和群体结构分析推断的群体结构，将680份栽培谷子聚为4个栽培亚组。作者首先检测了680份栽培谷子中主要单倍型的分布情况。有转座子插入的Hap 1强烈富集在C2亚组，分布在高纬度地区，而Hap 2多分布在C1，倾向于分布在低纬度地区(图4D )。作者的前期研究表明，C1和C2与类型1和类型2谷子大体一致，分别与春播型和夏播型一致。进一步对SiPRR37周围的1 844份材料(野生资源630份,地方品种829份,现代栽培品种385份)的FST进行两两分析，发现C1和C2亚群之间存在显著的人工选择(图4E )。这进一步证明了SiPRR37是驱动夏播和春播谷子分化的关键光周期开花调控因子。这些结果表明，SiPRR37的自然变异有助于谷子的生态适应。核苷酸多样性分析表明，栽培( C1、C2、C3)和野生谷子在SiPRR37基因区域的多样性均低于其侧翼区。这表明SiPPR37位点的低核苷酸多样性可能是自然选择而非人工选择的结果(图4F )。    

图4：SiPRR37的单倍型分析

先前的研究表明，PRR37同源基因在水稻和大豆中抑制开花。为了进一步明确PRR37同源基因在SD植株中调控开花的功能，利用CRISPR/Cas9基因编辑在水稻中敲除OsPRR37。2个独立纯合Osprr37突变体在NLD ( 6月24日播种)和NSD ( 7月24日播种)条件下开花显著晚于WT (日本晴) (图5 )，在SD ( 12 h光照/ 12 h黑暗)条件下开花显著晚于WT。此外，在极端SD ( 8 h光照/ 16 h黑暗)条件下，Osprr37突变体的抽穗期与WT基本一致。这些发现表明OsPRR37可以交替促进开花，这与OsPRR37在粳稻品种中花11中作为开花促进因子的发现一致。先前的研究表明，GmPRR37在大豆中作为LD依赖的开花途径的抑制子发挥作用。与SD ( 12 h光照/ 12 h黑暗)条件下得到的结果一致，在极端SD ( 8 h光照/ 16 h黑暗)条件下，Gmprr37突变体株系与受体亲本的开花时间仍无显著差异。这表明GmPRR37可能只抑制大豆开花。这些发现提供了明确的证据，表明PRR37同源基因在SD作物中存在功能分化。    

图5：CRISPR / Cas9诱导的Osprr37突变体的表型

为了探究Si PRR37如何根据光周期不同而调控开花，作者检测了Siprr37突变体和野生型在LD ( 16 h光照/ 8 h黑暗)和SD ( 12 h光照/ 12 h黑暗)条件下光周期开花调控关键基因的昼夜表达模式(图6 )。与野生型相比，在LD和SD条件下，Siprr37突变体中关键生物钟基因SiLCL ( LHY和CCA1)和昼夜节律输出基因SiGI的表达水平几乎不受影响。Siprr37株系中SiHd1在LD条件下表达下调，在SD条件下其表达峰值向ZT12偏移。作者检测了Siprr37突变体中3个成花素基因的表达情况，发现SiHd3a在Siprr37突变体中LD和SD条件下的转录水平均显著低于WT。与WT相比，Siprr37 + A突变体中SiFT5和SiRFT1在LD条件下ZT12附近显著上调，但在SD条件下大部分时间显著下调。最后，作者测定了两个MADS - box基因SiAP1和SiMADS15在Siprr37突变体和野生型中的转录谱。与WT相比，这两个基因在LD条件下的Siprr37突变体中显著上调，但在SD条件下的Siprr37突变体中被强烈抑制。这些结果表明，LD和SD条件下主要开花基因的转录变化可能部分解释了SiPRR37在不同光周期条件下调控抽穗期的双功能作用。    

图6：WT和Siprr37突变体在16 h光照/ 8 h黑暗和12 h光照/ 12 h黑暗条件下开花关键基因的日表达

为了进一步揭示SiPRR37在光周期开花途径中的作用，作者重点研究了SiHd1，其在Siprr37突变体和WT中的昼夜表达差异取决于光周期条件(图6 )。此外，已知Hd1同源基因是多种植物开花调控的枢纽基因。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在谷子中敲除SiHd1。作者获得了一个在靶位点插入1 bp的纯合突变体( Sihd1 + T) 。表型分析表明，在北京(图7A , B)的NLD条件下，Sihd1突变体的抽穗期比WT植株提前了3.4 d。然而，在北京(图7C , D)的NSD条件下，Sihd1突变体比WT植株晚开花5.7 d。这些结果证实，SiHd1在调控谷子抽穗期方面也具有双重功能。因此，作者的结果表明SiPRR37可能通过SiHd1调控开花，但需要进一步的研究来证实。    

图7：CRISPR / Cas9诱导的Sihd1突变体在北京地区自然光周期条件下生长的表型

研究结论与意义

在本研究中，作者揭示了SiPRR37在非诱导LD条件下抑制开花和诱导SD条件下诱导开花的双功能调控作用。作者根据光周期证实了SiPRR37改变了开花关键调控因子的昼夜表达。利用Crispr/Cas9技术敲除光周期开花调控中的枢纽基因SiHd1，发现SiHd1在开花调控中具有双功能作用。因此，SiPRR37调控抽穗的双重功能可能依赖于SiHd1。此外，Si PHYC在谷子中已被鉴定为LD条件下的开花抑制因子和SD条件下的开花促进因子。因此，光敏色素( PHYC )、昼夜节律组分( LHY和PRR37)和光周期开花关键调控因子( GI和CO)均具有调控开花的双功能作用，可能在SD植物中形成独特的光周期开花途径。作者的研究揭示了SD作物中SiPRR37的功能逆转和PRR37同源基因的功能多样化。这些发现不仅丰富了关于光周期开花调控的知识，而且有助于遗传改良。