2024年2月, 华中农业大学园艺林学学院/果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室徐娟教授课题组在《Proceedings of the National Academy of Sciences, PNAS》期刊在线发表了题为“Neofunctionalization of an OMT cluster dominates polymethoxyflavone biosynthesis associated with the domestication of citrus”的研究论文。该研究揭示了柑橘重要功能性成分聚甲氧基黄酮（Polymethoxyflavones，PMFs）的种质特异积累现象，鉴定了PMFs生物合成的关键串联重复OMT基因簇，同时解析了该OMT簇在柑橘亚科中的起源和演化历程，为柑橘果实功能性品质遗传改良提供了理论依据和重要基因资源。华中农业大学柑橘团队徐娟教授、陈嘉景副教授和徐强教授为论文的通讯作者，徐娟教授课题组已出站博士后彭昭欣博士（现就职于湖北省农业科学院经济作物研究所）为该论文的第一作者，华中农业大学果树学在读博士研究生宋立志为该论文的共同第一作者，华中农业大学邓秀新教授、Robert M. Larkin教授和王霞研究员，河南农业大学青年英才张海朋博士、贵州特色柑橘综合试验站站长李文云副研究员等参与了该项研究工作。该研究得到了国家重点研发计划（柑橘品质形成和保持机理与调控技术，2023YFD2300600）、湖北洪山实验室基金、国家自然科学基金和湖北省自然科学基金重点项目的资助。（原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2321615121）![]()
聚甲氧基黄酮（PMFs）是一种具有保健功能的天然生物活性化合物，具有显著的抗癌特性，可对抗胃癌、皮肤癌、乳腺癌、肺癌和其他一些癌症。据报道，O-甲基化部分对PMFs的立体结构和生物活性至关重要。与其他黄酮类化合物相比，多个O-甲基化的PMF更容易靶向和穿透癌细胞，并表现出广泛的抗炎活性来保护心血管系统和预防代谢紊乱。在COVID-19大流行期间，“陈皮Chenpi”是中国中药缓解相关症状最常用的成分之一。PMFs是负责Chenpi抗炎作用的主要生物活性成分。从柑橘Citrus depressa中提取的PMFs被鉴定为针对SARS-CoV-2刺突蛋白的多种变异的潜在抑制剂，特别是5-去甲基降胆素。柑橘中的脂溶性PMFs主要分布在果皮、叶子和花中，在那里它们提供了抵御病原体和紫外线（UV）辐射的基本屏障。
不同植物种类之间的类黄酮含量差异很大。在菊科、唇形科、豆科和芸香科的植物中已鉴定出多种O-甲基化黄酮类化合物。高度O-甲基化的PMFs在柑橘中最为丰富，并且已经从柑橘的不同物种中提取出来，特别是从柑橘果实的果皮中提取出来。柑橘属于芸香科科柑橘亚科亚科，包含33个属，210个种。基因组分析将柑橘分为3个不同的类群：柑橘相关属、早期分化柑橘和驯化柑橘。驯化柑橘可进一步分为3组，包括宽皮柑橘组、柚-香橙组，以及由金柑( Fortunellaindsii )、多花金柑( C.polyandra )、青冈( C.glauca )和澳洲柑橘( C.australasica )组成的一组。大多数现代柑橘品种来源于三个基本品种，宽皮橘（C. reticulata），柚子 (C. grandis)和香橼（C. medica）。然而，显著的种间渐渗特征有助于栽培的柑橘和柑橘杂种的多样化。事实上，许多控制类黄酮生物合成的基因在驯化过程中都受到了选择。例如，Ruby2-Ruby1基因团簇已经被亚功能化，用于调节花青素的生物合成。近年来，该团队分析了116种柑橘种质的PMF图谱，发现不同柑橘品种的果实黄酮和叶片的PMF含量存在差异。鉴于PMF具有显著的抗癌特性及其不同的结构和物种特异性的积累模式，研究PMF代谢途径的遗传基础至关重要。
一系列的羟基化、糖基化和甲基化反应有助于类黄酮的多样性。黄酮类化合物O-甲基转移酶（O-methyltransferases，OMTs）、类黄酮类羟化酶和黄酮O-去甲基化酶影响PMFs的积累。羟基化是黄酮最常见的修饰。事实上，78%的黄酮类化合物是羟基化的。此外，羟基化往往优先于甲基化。OMTs在催化羟基化黄酮的末端修饰中起着关键作用，通常有助于植物中特殊代谢物的生物合成。OMTs在催化羟基化黄酮的末端修饰中起着关键作用，通常有助于植物中特殊代谢物的生物合成。OMTs通常表现出较高的底物特异性，如薄荷（Menthax piperita）和甜罗勒（Ocimum basilicum）。一般来说，串联重复基因簇（Tandemly duplicated gene clusters, TDGCs）包含同源基因，而植物生物合成基因簇（BGCs）包含两个或两个以上的非同源基因，编码涉及同一生物合成途径的酶。一个由5个OMT基因组成的TDGC有助于黄芩（Scutellaria baicalensis）中黄芩素的生物合成。9个已测序的柑橘基因组被预测含有38 ~ 111个OMT基因。具体来说，'莽山'橘(C. reticulata Mangshan )、'克莱门汀'橘(C. reticulata Clementine)和甜橙的OMT基因最多，从105到111不等。然而，南瓜、香橼、宜昌木瓜、金桔和中国盒橙的OMT基因较少，从38到79不等。C.depressa的CdOMT5对单羟基黄酮的C3、C5、C6和C7羟基具有较低的o-甲基化活性。“Ougan”柑橘的CrOMT1可以催化高效的O-甲基化，这在柑橘中微量存在。柑橘的OMT可以有效地将O-甲基化C3’OH基团，而两个富含嗜酒素的柑橘的CitOMT2可以在C8-OH上O-甲基化7,8-二羟基黄酮，具有严格的底物特异性。虽然有充分的文献表明柑橘物种积累了含有3-7个甲氧基的不同PMFs，但柑橘中控制PMF生物合成的关键调控机制和遗传机制尚未得到系统的研究。
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研究者在147份柑橘材料中检测到PMF水平的广泛分布，包括柑橘相关属、早期分化柑橘和驯化柑橘。PMFs在柑橘近缘种和早期分化柑橘种中未检测到。同样，在驯化的柑橘中也没有检测到PMFs。值得注意的是，柑橘显示出非常高的11种PMFs水平。与现代栽培柑橘相比，野生柑橘和早期混合柑橘的果实黄累积的总PMFs和四种主要PMFs水平明显更高，包括褐皮素（NOB）、橘皮素(TAN)、柑橘素(SIN)和5-去甲基褐皮素(5- DNOB)。此外，来自柑桔，如甜橙、酸橙和葡萄柚的品种积累了不同水平的PMFs。![]()
图1 不同柑橘品种间PMF含量的差异。
2.负责PMF生物合成的OMT簇的鉴定
研究者将积累PMF的C. reticulata“Red tangerine”(RT)与不积累可检测到的PMF水平的“Trifoliata orange”(TO)杂交，构建了一个F1群体。F1个体在果实黄和叶片中均表现出不同水平的PMF积累。分别收集了PMFs积累水平高和低的个体的组织，然后通过散装分离分析比较两个不同的池。结果显示，在支架2和4上有明显的峰，这与控制PMFs积累的两个位点一致。为进一步确定这些峰值是否表明促进PMFs积累的主要位点，研究者使用了一个不同的分离群体，该群体来自PMFs水平低的C. reticulata Clementine (CLM)和PMFs水平检测不到的“Precocious trifoliata orange(PTO)”的杂交。通过BSA对该群体进行分析，结果表明有三个位点控制PMFs的积累。两个群体的BSA结果重叠，从而在scaffold 4上定义了一个360- kb的候选区域，该区域包含18个预测基因。在该候选区域鉴定出五个高度同源的O-甲基转移酶基因，包括CreOMT3、CreOMT4、CreOMT5、CreOMT7和CreOMT8。CreOMT7和CreOMT8是非功能性假基因，因为它们缺乏保守的PF08100结构域，而PF08100结构域是功能性植物O-甲基转移酶的标志。选择剩余的OMT作为柑橘PMF含量差异的候选基因，进一步进行了综合代谢组学和转录组学分析。HPLC分析结果显示，PMFs在RT黄酮中大量积累，但在RT汁囊和“华农红”柚黄酮和TO中未检测到。对这些样本的转录组分析显示，共有30个OMT基因存在RT-F相对于RT-J和HR-F相对于TO-F的差异表达。CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5的表达水平在RT-F中上调，PMF积累水平较高。进行Pearson相关性(r≥0.6)分析以筛选参与PMF生物合成的候选基因。因此，CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5的表达水平与总PMF的积累高度相关。相比之下，CreOMT7、CreOMT8和CreOMT9的表达水平与PMF含量无关。研究者进一步测试聚集的CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5基因(以下简称OMT基因簇)是否为PMF生物合成的关键OMT基因。![]()
图2 柑橘PMF生物合成主要位点的定位。
3.CreOMT3, CreOMT4和CreOMT5是多功能O-甲基转移酶
研究者将28个羟黄酮底物喂给酵母菌株，表达候选OMT基因。对重组CreOMTs在黄酮骨架上的每个羟基化位点的转化效率进行了评估。每种OMT O-甲基化特定羟基的效率不同。总的来说，这三种CreOMTs表现出显著的催化效率。研究者用可溶性重组CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5进行酶活性测定，结果发现CreOMT4 和CreOMT5都能有效催化含有芳香邻羟基和间羟基的羟黄酮的O-甲基化。后将等量的CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5组合在相同的反应混合物中(以下简称OMT3+4+5反应)。结果表明对于API和DMF2，CreOMT3、CreOMT4或CreOMT5的任何单个酶都不能单独将API和DMF2上的所有羟基O-甲基化以产生API- TMF和TMF3。对于DIO，CreOMT4或CreOMT5都可以将所有三个羟基O-甲基化，生成TMF3。相反，OMT3+4+5反应产生多种PMFs，并且能够完全O-甲基化黄酮。换句话说，尽管CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5具有区域选择性，但它们可以协同工作以产生完全O-甲基化的黄酮。表1 不同羟黄酮底物重组CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5的动力学性质![]()
4.CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5的功能分析
研究者分别在柑橘愈伤组织悬浮培养系统中过表达CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5。结果显示，过表达系在C5、C6、C7、C8、C3’和C4’位点积累了6种羟黄酮的O-甲基化衍生物，导致6种羟黄酮的产生PMFs。这些数据强调了OMT簇在PMF生物合成中的重要性。为了进一步探索OMT集群在PMF生物合成中的作用，研究者们在“Guoqing No. 1”柑黄中分别瞬时过表达CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5，并将其与空载体对照进行了比较。数据表明，OMT过表达增加了黄叶中ISIN、SIN、NOB、HPMF、8—OH—HXMF和TAN的水平。体外酶促实验表明，CreOMT4和CreOMT5可以连续地将5DNOB转化为NOB。这些数据为CreOMT4—OE和CreOMT5—OE黄酮中5DNOB水平降低提供了理论依据。此外研究者使用RNA干扰(RNAi)下调大田本柑中CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5的表达。RNAi果实的黄酮显示CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5的表达水平降低。基于CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5的酶活性和底物区域选择性，以及在柑橘种质和组织中观察到的PMF谱，研究者提出了柑橘特异性PMF生物合成途径。CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5在羟黄酮的O-甲基化中是互补的，并有助于产生七种柑橘特异性PMFs。![]()
图3 CreOMT3、CreOMT4和CreOMT5在PMF生物合成中的关键作用。
5.OMT集群可能是从OMT6复制而来
PMFs在芸香科的某些特定物种中含量丰富。研究者对芸香科进行了比较基因组分析。对PMFs总量积累较高的物种C. reticulata的分析显示，相对于其祖先，其基因家族扩增了1373个，收缩了4399个。共鉴定出25个OMT基因家族,其中12个家族经历了扩展。在这些OMT基因家族中,GF199(0G0000199)包括CrmOMT3、CrmOMT4、CrmOMT5和CrmOMT6。利用柑桔和甜瓜的OMT3、OMT4、OMT5基因序列构建了系统发育树。由OMT3、OMT4和OMT5组成的支系与OMT6支系不同。系统发育树表明，OMT3、OMT4、OMT5和OMT6在各自的进化枝内与其他基因是同源的，并且在进化枝之间是同源的。采用Synteny分析法分析柑橘OMT聚类与OMT6的系统发育关系。CreOMT6可能来源于AbOMT6，因为CreOMT6和其他OMT6基因与AbOMT6是同源共线的。数据证明这些基因是在柑橘驯化过程中被选择的，因此可能在柑橘PMF代谢途径的进化中发挥了重要作用。![]()
图4 OMT聚类的进化历史和PMF生物合成的潜在能力。
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图5 CreOMT3-CreOMT6的表达谱和启动子变异对不同类型柑橘种质中PMF含量的影响。
6.OMT6在柑橘中的作用
为了确定CreOMT6是否参与柑橘PMF生物合成途径，研究者通过Pearson相关分析发现在红橘果实发育的不同阶段，CreOMT3、CreOMT4、CreOMT5和CreOMT6的表达量与PMF总量呈高度相关。OMT集群在野生和早期混合柑橘中表达水平较高，而在现代栽培柑橘和柑橘衍生品种中表达水平较低，这与它们的总PMF水平相关。为了确定OMT6是否有助于PMF的生物合成，研究者从9个基因中克隆了OMT6同源物，并从每个基因中产生重组OMT6，发现在C5、C6、C7、C3′和C4′上，AbOMT6 O-甲基化了8种不同的底物。然而，来自其他物种的OMT6只能在C3、C5和C7位点微弱地O-甲基化或不能O-甲基化羟黄酮。虽然AbOMT6具有与CreOMT4和CreOMT5相似的强有力的O-甲基化活性，但它在原始柑橘中没有表达，这意味着CreOMT4和CreOMT5的新功能化。![]()
图6 柑橘类植物中OMT集群和OMT6的进化史。
7.对CreOMT4和CreOMT6 的O-甲基化活性至关重要的氨基酸残基
虽然CreOMT4和CreOMT6的氨基酸序列具有94.62%的一致性，但它们的活性却有显著差异。研究者对纯化的所有OMT蛋白进行了氨基酸序列比对。第17个氨基酸残基在CreOMT4中为Asn (N)，在CreOMT6中为Asp (D)。第168个氨基酸残基在CreOMT4中为Thr (T)，在CreOMT6中为Ala (A)。考虑到CreOMT4和CreOMT6不同的多位点O-甲基化活性，使用位点定向诱变来测试这些残基是否通过在CreOMT4和CreOMT6中交换它们来影响这些酶的活性。然后将它们的活性与野生型CreOMT4和CreOMT6进行O-甲基化分析。发现CreOMT6- D17N可使羟基黄酮的C3、C5、C6和C3 '位点O-甲基化。8.OMT4启动子中含有1041 bp片段的MITE对PMF积累的影响
研究者发现了一个1041 bp的片段，包含两个MITEs位于芒山柑橘和大田Ponkan柑橘OMT4基因翻译起始密码子上游654 bp处，但在栽培柑橘Clementine中没有。采用瞬时双LUC分析方法对两个来源的1041 - bp片段和OMT4启动子的转录活性进行了评估:缺少1041 - bp片段(CreOMT4—Pro)的现代栽培Clementine和存在1041 - bp片段(CrmOMT4—P1)的莽山柑。在用携带不同质粒的土壤杆菌菌株浸润本氏烟草叶后，发现CrmOMT4—P1产生的LUC活性水平比CreOMT4—Pro高三倍，，证实了1041 bp片段诱导CreOMT4表达增加。这些数据表明，含有两个MITEs的区域可以诱导CreOMT4的表达增加。为了确定1041 bp DNA片段对PMF含量的影响，对72个柑橘进行了基因分型，已知的3种野生柑桔均表现出高水平的PMF积累，并且只含有一个长1041 bp片段的OMT4启动子。为了测试1041 bp片段是否存在于柑橘的OMT4启动子中，设计了一种特异性引物用于PCR基因分型，以证明其存在于19种野生柑橘和29种早期混合柑橘中，这些柑橘具有高PMF含量。相反，在PMF含量低的现代栽培大麦中该片段被删除。这些结果进一步证实了含有两个MITEs的1041 - bp片段对PMF代谢有显著影响。现代栽培柑橘OMT4启动子中该片段的缺失可能是其OMT4基因表达和PMF含量较低的原因。PMFs是一类具有显著抗癌特性的天然生物活性化合物，对于人体具有积极的健康作用，它们在柑橘中含量丰富，但是PMF生物合成的遗传基础仍然未知，这使得培育高PMF含量的重要作物具有挑战性。该文章基于对PMF显著的抗癌特性及其不同的结构和物种特异性积累模式，有必要研究PMF代谢途径的遗传基础。研究者利用正向和反向遗传学鉴定了编码OMTs并参与PMF生物合成的三个串联复制基因簇，并证明编码的OMT蛋白有助于PMF的生物合成。通过基因组分析，研究者们提出了柑橘驯化过程中OMT基因扩增和随后新功能化的PMF生物合成可能的进化轨迹。研究还发现，现代栽培柑橘中OMT基因表达的降低可能与驯化过程中的选择有关，这说明驯化过程中可能存在对植物代谢途径的广泛影响。
该文章的发现为通过育种或代谢工程改善柑橘作物的PMF含量提供了重要的见解，该研究结果对提高柑橘作物的抗癌特性和营养价值具有实际应用价值。并且随着基因编辑的不断发展，未来有可能对这些OMT基因进行编辑，以提高柑橘类作物中的PMF含量，有助于未来开发功能性食品。鉴于PMFs显著的抗癌特性，未来还可以对改良过的柑橘（PMFs含量增加的柑橘）对人体健康产生的影响开展长期的研究。
