2025年1月23号，中国水稻研究所水稻生物育种全国重点实验室张健研究员团队和华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室、湖北洪山实验室张建伟教授团队在国际著名期刊Advanced Science（IF:14.3）在线发表“Global Protein Interactome Mapping in Rice Using Barcode-indexed PCR Coupled with HiFi Long-read Sequencing”的研究论文，成功研发一种低成本、高通量鉴定蛋白互作技术—BIP-seq，并在模式植物水稻中成功鉴定到超过23032个蛋白互作组合，为解析水稻及其它物种的蛋白互作网络提供了强有力的技术支持和数据支撑。
蛋白-蛋白相互（Protein-protein interaction, PPI）是蛋白质精准调控生物学过程的重要形式。自1989年首个蛋白互作鉴定技术酵母双杂交（Y2H）诞生以来，PPI鉴定已成为现代生物学的主要研究内容。然而，经典的PPI鉴定技术（如Y2H, BiFC, Co-IP，GST Pull-down等）局限于少数蛋白的互作关联，通量和效率偏低。近年来，科学家们尝试开发了多套高通量PPI鉴定技术体系，如基于双杂交系统的Stitch-seq、CreY2H-seq等，基于质谱系统的AP-MS、CF-MS等，但均难以兼顾通量高、周期短、成本低、仪器依赖程度低等需求，限制了其在非模式物种和小型分子生物学实验室场景中的应用。
BIP-seq（Barcode-indexed PCR Coupled with HiFi Long-read Sequencing）利用“库对库（library versus library）”的酵母双杂交策略快速获得数以万计的随机的阳性PPI互作组合酵母克隆，通过两轮Barcode-indexed PCR将每个酵母克隆中Bait和Prey载体上的cDNA序列直接扩增，并在序列末端添加2套条形码用于判断克隆的来源。最后，通过HiFi long-read测序方法将数万个扩增子进行混合测序。具有完全相同的barcode的Bait cDNA和Prey cDNA表明它们来自相同的阳性PPI互作酵母克隆，即为互作组合。
BIP-seq工作流程示意图
此外，该团队还研发了经济、稳定的酵母菌落PCR系统（~10元/96样品）、半自动热循环工作站（成本~4万元，可在3小时内完成超过80个96或384孔板扩增）和96针复制器（快速转移PCR扩增所需模板），大幅提升了操作效率，并在2个月内完成60,000个酵母菌落的互作蛋白鉴定和分析，绘制了包含23,032个（准确率~62.5%）水稻互作蛋白图谱RiPPID，其中22,665个为新发现的互作组合，极大的扩展当前水稻蛋白互作网络的覆盖范围。
BIP-seq具有高效率、低成本、可操作性好、无需依赖贵重仪器等优势，是中小型分子生物学实验室在有限经费支持下开展蛋白互作组研究的利器。鉴于该技术的通用性，BIP-seq还可延伸到不同的物种内、物种间（模式物种 vs 非模式物种，病原菌 vs 宿主）、杂交技术系统（细菌双杂交、酵母单杂交）等不同场景，具有重大的应用价值。
TCS工作站与96针复制器
中国水稻研究所张健研究员和华中农业大学张建伟教授为该论文的通讯作者，中国水稻研究所刘西西博士、华中农业大学硕士研究生夏丹丹、已毕业中国水稻研究所与湖北大学联合培养硕士研究生罗金金和华中农业大学硕士研究生李梦圆为该论文的共同第一作者。浙江大学都浩研究员、中国农业科学院深圳农业基因组所常玉晓研究员、浙江农林大学赵娟副教授和中国水稻研究所鄂志国副研究员为本研究做出了重要贡献。该工作得到国家重点研发项目（2022YFE0125600和2020YFE0202300）、浙江省高层次人才专项支持计划（2022R52020）、国家自然科学基金项目（U22A20456, W2412006和32072050）、中央公益性科研机构基础科研基金项目（Y2023PT17）、湖北省洪山实验室重大项目（2022HSZD031）、中国博士后科学基金面上项目（2024M763606）、中国农业科学院农业科技创新项目以及浙江省自然科学基金项目（LD24C130001）的资助。同时，该工作也得到水稻生物育种全国重点实验室仪器共享平台和作物遗传改良国家重点实验室高性能计算平台的支持。
文章链接：https://doi.org/10.1002/advs.202416243
中国水稻研究所张健团队：https://www.x-mol.com/groups/cnrriseeddev
华中农业大学张建伟团队：https://zhang.hzau.edu.cn/
