量子点（Quantum Dots，QDs）是一种化学性质稳定，亮度高于多数常用荧光染料，具有高紫外线吸收能力、大斯托克斯位移点和极高的耐光性的光化学信标材料。本文作者将CRISPR/Cas体系与量子点结合，开发了一种免扩增核酸检测方法[4]。
作者选用QD525的量子点，其内核由硒化镉组成，包覆一层硫化镉，最外层使用硫化锌覆盖。在量子点的最外层，使用CL4配体，增加整个量子点的稳定性，使量子点表面的对于CRISPR/Cas酶的空间位阻最小化。其他组成部分包括两条DNA/RNA核酸链（取决于后续CRISPR/Cas体系是Cas12a还是Cas13a）。其中一条红色核酸（图1），一端修饰HisTaq，基于组氨酸与2价阳离子的结合原理，将该核酸固定到量子点表面。另外一条核酸链一端与红色核酸配对，另一端修饰Cy3荧光染料，同时中间部分包含一个远离量子点的发卡结构，方便后续CRISPR/Cas体系进行反式切割。
在该结构的作用下，量子点的荧光会被外层的Cy3染料淬灭。该淬灭原理是基于Förster 共振能量转移（FRET），即激发状态的量子点电子，从能量供体（此处为量子点QD525）转移到能量受体（此处为Cy3），从而消除量子点本该辐射出的能量信号，达到淬灭效果。在信标稳定的情况下，量子点不向外辐射出荧光信号，而是由FRET效应，将能量转移到Cy3染料（i），但是当体系中出现激活状态的CRISPR/Cas酶，Cy3染料修饰的核酸在发卡结构处被反式切割截断（ii），量子点与Cy3分离后就会辐射出荧光信号（iii）。
为了研究分子信标体系的整体性能，作者分析了不同浓度比例时，信标系统的荧光特征。当量子点为100 nM时，Cy3比例从0逐级提升到12，在350 nm的激发光源照射下，量子点发射波强度逐级递减（峰值大约在528 nm处），而Cy3发射波强度逐级增加（峰值大约在570 nm处）。与此同时，整个体系中有一个平衡点，数值大约在554 nm处，可作为系统内的固定参照值（图2d）。基于Förster 共振能量转移效率（FRET Efficiency）计算值（左Y轴）和Cy3-QD525估算距离（右Y轴），在荧光染料和量子点比例分布（X轴）会得到一条在6:1（Cy3:QD525）比值以上趋于平缓的线条。为了鉴定荧光激发状态的变化量，作者使用了604 nm的发射强度比上528 nm处的发射波强度。当Cy3：QD525在2及以上时，其比值变化规律接近于一条直线。如果选取不同发射波长，进行两者的对比，在5倍于QD525的Cy3浓度下，其比值可以超过200倍。
首先，作者将QD525浓度固定在100 nM，经过酶切和在350 nm激发光源的观察下，经过37℃和长达2 h的反应后，其normalized PL Ratio逐级递减（图3b）。而LbCas12a的反应速率不受Cy3：QD525比例的影响（图3c）。该情况较少见，由于量子点表面存在大量配位空间时，容易结合各种蛋白或者酶，从而导致其活性降低，体系内反应速率下降。但是在该实验中，Cy3的数量从2倍提升到10倍时，并没有发现LbCas12a存在活性变化。而在第二轮验证中，作者选择了Cy3 200 nM的终浓度，且从2:1开始（100 nM QD525）降低QD525浓度。最终作者认为当Cy3与QD525在6:1的比之下组成的信标分子最适用于该检测体系（图3d，3e）。
针对Cas12a系统，作者使用了靶标浓度5 pM到5 nM的目标ssDNA。针对Cas13a系统，作者选用了10 pM到10 nM的目标RNA浓度梯度。在Cas12a体系下，4 h后，当DNA靶标浓度高于500 pM时，所有的信标都会被切断并释放荧光信号。而当靶标换成RNA时，在Cas13a体系下，信标的消化速率显著下降，2 h内在任何靶标浓度下均有未被完全消化的信标。考虑到反应时间，作者选取了1 h节点为检测限分析的依据。截止1 h的反应时间内，DNA检测体系的检测线大约在50 pM，而RNA检测体系的检测限大约在100 pM（图4）。
作者针对该体系准备了4组实验，分别为仅含10 nM dsDNA靶标、仅含10 nM RNA靶标、同时含有两种靶标、不含任何靶标。令人意外的是，在读取QD525-Cy3检测RNA靶标的数据时，仅含dsDNA靶标的体系也起了信号(图5e）。在读取QD625-Cy5检测DNA靶标的数据时，不含DNA靶标的体系荧光值显著低于含DNA体系的荧光值（图5f）。说明在以上系统中，Cas12a的反式切割体系在被激活的状态下可以剪切RNA信标，从而形成假阳性信号。理论上该缺点可以通过选用反式切割活性对RNA不敏感的Cas12a酶进行改进。
图5.RNA/DNA混合检测体系
图6.快速检测体系
该研究体系也给出了两个不同的应用方向，一个是多靶标检测，一个是即时检测。其中多靶标检测对CRISPR/Cas蛋白的特异性有较高的要求。在即时检测方面，合适的相机和图形分析软件也相当重要。
参考文献：
[1].Huyke, D. A.; Ramachandran, A.; Bashkirov, V. I.; Kotseroglou,E. K.; Kotseroglou, T.; Santiago, J. G. Enzyme Kinetics and DetectorSensitivity Determine Limits of Detection of Amplification-FreeCRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13 Diagnostics. Anal. Chem. 2022,94, 9826−9834
[2].Gong, S.; Zhang, S.; Wang, X.; Li, J.; Pan, W.; Li, N.; Tang, B.Strand Displacement Amplification Assisted CRISPR-Cas12a Strategyfor Colorimetric Analysis of Viral Nucleic Acid. Anal. Chem. 2021,93,15216−15223
[3].Luo, T.; Li, J.; He, Y.; Liu, H.; Deng, Z.; Long, X.; Wan, Q.;Ding, J.; Gong, Z.; Yang, Y.; Zhong, S. Designing a CRISPR/Cas12a-and Au-Nanobeacon-Based Diagnostic Biosensor Enabling Direct,Rapid, and Sensitive miRNA Detection. Anal. Chem. 2022,94, 6566−6573.
[4].Christopher M. Green, Joseph Spangler, Kimihiro Susumu, David A. Stenger, Igor L. Medintz, and Sebastián A. Díaz 2022, Quantum Dot-Based Molecular Beacons for Quantitative Detection of Nucleic Acids with CRISPR/Cas(N) Nuclease, ACS Nano, Vol 16 Issue 12, pp 20693-20704, DOI: 10.1021/acsnano.2c07749
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