DNA甲基化是一种DNA的共价修饰，具体是指DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）将甲基加到DNA CpG序列中胞嘧啶的5'碳位，形成5-甲基胞嘧啶的过程。成簇的CpG被称为CpG岛（CpG islands，CGIs），主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域。DNA甲基化标志物是癌细胞中的DNA异常甲基化改变，这种异常甲基化贯穿于癌症发生和发展的全过程。与传统的肿瘤标志物相比，DNA甲基化标志物具有更早期、更无创、更精准等优点。因此，可以通过非侵入性方式获得的痰液、血浆、血清或尿液等样本进行DNA甲基化标志物检测。一些DNA甲基化异常发生在肿瘤形成的初始阶段，通过检测与肿瘤发展相关的甲基化标志物，可以辅助癌症早期诊断、评估进展风险。DNA甲基化标志物甲基化水平的增加或降低与肿瘤预后密切相关，可用于治疗或根治性手术后评估肿瘤微小残留病灶（MRD）和监测复发。此外，DNA甲基化标志物还可作为化疗敏感性的标志，某些特定基因的甲基化可能预示着癌症对治疗的反应，可用于判断化疗药物的疗效，以更好地指导治疗方案。
细胞基因组与游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）均可用于肿瘤DNA甲基化检测，常采用组织、血液样本，也可采用尿液、浆膜腔积液、灌洗液、粪便、拭子等样本。针对不同样本类型还应注意以下事项：⑴组织样本。组织样本离体后应在低温、水合状态下保存和转运。如不能立即开展后续处理，可选择将组织置于-70 ℃及以下环境，以长期保存；或者制成石蜡包埋组织（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE），可于室温保存3~5年。⑵血液样本。采集血浆标本，抗凝剂选用EDTA或枸橼酸，不可使用肝素。检测cfDNA时建议足量采集2×10 mL全血。溶血、脂血和黄疸标本建议重新采集。样本运输过程中应避免机械应力致血细胞破裂，气动管道运输可能增加细胞基因组DNA释放。目前，临床肿瘤DNA甲基化分析常检测的血液组分包括外周血单个核细胞（peripheral blood monocyte，PBMC） 、循环游离DNA（circulating cell-free DNA，ccfDNA）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），但不同组分的生物学特点存在差异（表2）。采用普通抗凝采血管时，采集后至分离不宜超出4~6 h，因为后续白细胞稳定性会下降；如条件限制、延迟分离不可避免，则在4 ℃下保存不超出24 h。采用添加防腐剂的采血管时，建议在3 d内进行分离。转移无细胞血浆时应严格避免混入细胞及细胞碎片，并转移至低DNA吸附管中保存。分离待测组分前不可冷冻保存含有红细胞的全血样本，以免严重溶血。经分离后待测组分可在-70 ℃及以下长期保存，注意避免反复冻融，而且解冻过程需置于冰上缓慢进行。⑶新鲜体液及灌洗液样本。如样本含较多血液成分，可进行抗凝处理，避免室温下长时间放置。可通过高速离心及超滤技术富集分离细胞或cfDNA。经分离后，待测组分的处理同血液样本。⑷粪便样本。粪便样本含大量微生物，采集保存过程应遵循所用试剂耗材说明并尽快送检，缩短DNA抽提前非冷冻保存及运输时间。推荐使用含防腐剂保存液，以减少人源性DNA降解。⑸拭子样本。应使用专用采集器，采样后可置于保存液或风干保存。风干拭子室温下保存不超过3 d，后续操作前需加入缓冲液重悬；在保存液中，拭子样本在2~8 ℃下保存不超过7 d，-20 ℃下保存不超过30 d。
2.2.1 DNA提取与纯化 宜根据样本类型、检测目的选择DNA提取纯化方法，临床常采用离心柱法和磁珠法。提取纯化应在专门区域内进行，cfDNA与细胞、组织样本应分区处理，以避免基因组污染。推荐使用自动化提取设备，以减少批次间差异。提取后宜尽快检测，长期保存应避免反复冻融（建议≤3次）。针对不同检材，抽提前还应注意以下操作事项：⑴组织检材。取材应选取细胞密集区域，避免出血、坏死、自溶部分。肿瘤细胞比例含量<20%时建议富集。新鲜组织块应经液氮冷冻后研磨或使用设备破碎匀浆。FFPE样本切片厚度以8~10 μm为宜，脱蜡后予酶消化去除蛋白、脂质等物质，消化酶处理条件较新鲜组织浓度高（>20 g／L）、时间长（3~5 h）。⑵细胞检材。粪便、体液、灌洗液、缓冲液拭子等样本可用于富集脱落细胞，其中粪便样本应以缓冲液或裂解液充分振荡、裂解，离心去除不可溶性沉淀物后再操作。⑶cfDNA检材。抽提过程中选用特定磁珠产品可保留较完整DNA、富集较短DNA片段，高效分离核酸有利于下游甲基化检测。cfDNA经提取纯化后应评估片段分布，以排除基因组DNA污染。
2.2.2 DNA转化 目前DNA转化的主流技术包括基于化学试剂的重亚硫酸盐转化和基于酶法的温和转化，而甲基化敏感的限制性内切酶技术（methylation sensitive restriction endonuclease PCR，MSRE-PCR）无需转化处理。
NGS可以同时进行数百个至全基因组的DNA甲基化检测，检测通量高，但技术和操作复杂。DNA甲基化检测的文库构建策略分为“先建库后转化”和“先转化后建库”两种。cfDNA检测主要包括5个步骤：DNA提取、文库构建、测序、生信分析和报告解读。NGS平台应结合客观条件和诊治需要选择不同的基因panel，用于癌症早筛的NGS检测需要进行前瞻性临床试验。目前尚无获批临床使用的基于NGS平台的DNA甲基化检测产品，部分产品在注册评审过程中或以实验室自建检测方法（laboratory developed test，LDT）形式进行检测服务，适用于单癌种、多癌种或泛癌的检测。
核酸质谱平台基于基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）技术，可同时检测数个至数十个DNA甲基化标志物，可实现中通量级别的稳定检测，可以获得最大500 bp范围之内全部连续的CpG位点的甲基化定量水平。部分检测机构提供LDT检测服务，适用于单个或多个肿瘤的检测。检测时需注意避免反应体系中的Na+、K+等盐离子残留导致核酸峰的位置漂移，样本和基质的结晶要充分，仪器的质量校准要定期校对，校准准确度在400 ppm及以下，分辨率在400及以上。
利用外周血进行cfDNA甲基化检测是近年来针对肿瘤早期进行无创诊断的重要方式。2008年已有研究证实结肠癌组织SEPTIN9基因启动子存在不同程度甲基化，并提出外周血SEPTIN9 甲基化可用于结直肠癌（colorectal cancer ，CRC）早期筛查 。2024年，《新英格兰医学杂志》连发两篇关于CRC无创筛查的研究成果，其中一款基于血液 cfDNA 基因组变异、DNA甲基化状态和碎片组模式的CRC早期筛查工具Shield，在ECLIPSE研究中诊断CRC的敏感性为 83.1%（95%CI：72.2%~90.3%），特异性为 89.6%（95%CI：88.8%~90.3%）。通过检测LASS4、LRRC4、 PPP2R5C和ZDHHC1基因甲基化筛查,CRC的BLUE-C研究显示，其检测敏感性为 93.9%（95%CI：87.1%~97.7%）；检出晚期癌前病变的敏感性为 43.4%（95%CI：41.3%~45.6%），对非肿瘤性发现或阴性结肠镜检查的特异性为 92.7%（95%CI：92.2%~93.1%）。国内一项纳入1 381例患者的多中心前瞻性研究证实RNF180和SEPTIN9基因甲基化是理想的胃腺癌标志物，对早期胃癌（Ⅰ期、Ⅱ期）的检测灵敏度远高于CEA、CA199、CA125等传统的蛋白肿瘤标志物。《中国早期胃癌筛查检验技术专家共识》首次提出，RNF180/Septin9基因甲基化检测可用于早期胃癌筛查，联合检测RNF180、Septin9基因甲基化和肿瘤标志物可进一步提升胃癌筛查的灵敏度。通过在肺泡灌洗液中联合SHOX2和RASSF1A甲基化检测对肺癌的总体诊断结果均优于单纯的细胞学检查，对肺癌的早筛早诊具有积极的临床意义。采用外周静脉血进行靶向DNA甲基化测序，构建PulmoSeek模型用于辅助临床医生建立肺结节良恶性诊断模型，有助于提高早期肺癌的诊断。国内研究团队通过cfDNA的 DNA甲基化水平构建早期肝癌诊断预测模型，结果发现基于 cfDNA甲基化的预测模型对早期肝癌的灵敏度和特异度均优于传统血清标志物。
DNA甲基化技术也可以应用于宫颈癌筛查的高危分流，能对人乳头瘤病毒（HPV）阳性患者进行初步分流。上海交通大学附属国际和平妇幼保健院团队建立了纳入3 251例hrHPV阳性女性的前瞻性研究队列，对HPV检查的剩余样本进行PCDHGB7基因甲基化检测，与细胞学检测相比，PCDHGB7甲基化检测减少了62.2%的非16/18型高危hrHPV阳性女性的转诊，显示出更为优越的特异度（92.1% vs 74.9%）。
随着癌症筛查技术的不断进步，临床上主要有两种多癌种筛查策略，第一种是以全癌标志物为代表的单一标志物的全癌种筛查，第二种是结合了组织溯源技术的多个肿瘤标志物组合筛查策略。
随着技术的发展，cfDNA甲基化与其他组学信息的整合极大地提高了肿瘤早期筛查的准确性。Van Thien Chi Nguyen研究团队应用cfDNA甲基化组学和片段组学信息，在乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌和肺癌等5类肿瘤中进行诊断验证，敏感性为72.4%、特异性为97.0%。清华大学研究团队通过cfDNA甲基化特征构建SRFD-Bayes诊断模型，在乳腺癌、结肠腺癌、肺鳞癌、肺腺癌、肝细胞癌和前列腺癌等肿瘤中进行验证，该模型对肿瘤定位的平均准确率为76.9%，肿瘤早期检测的敏感性为86.1%，特异性为94.7%。
DNA甲基化标志物在肿瘤筛查中有几大优势：⑴具备肿瘤特异性。在不同的肿瘤阶段，DNA甲基化位置和甲基化水平存在差异，而异常的DNA甲基化是肿瘤的特征之一。⑵发生在肿瘤早期甚至癌前病变阶段。这些DNA甲基化的表观遗传变化大部分发生在肿瘤的早期，并持续存在于肿瘤发展全程，且在全部肿瘤类型中普遍存在。⑶可以液体活检。肿瘤组织中的DNA甲基化片段可以释放到血液和体液中，以ctDNA的形式存在，并可在血液中被稳定地检测。⑷不受干扰。克隆造血导致的突变对检测血液中ctDNA的突变造成很大的影响，而检测ctDNA的甲基化不受影响。因此，在基于血液ctDNA的液体活检中，检测ctDNA甲基化比检测ctDNA突变更准确。
病理诊断（包括细胞和组织病理学检查）可能会受标本质量和病理学家诊断水平的影响，新兴的分子诊断方法如DNA甲基化检测具有良好的组织特异性，更加敏感和客观，可以克服形态学诊断的固有缺陷。
目前常见的含有肿瘤脱落细胞的标本类型主要有脑脊液、胸腔积液、腹腔积液、尿液、肺泡灌洗液等体液，以及粪便、宫腔表面刷取物、痰液等。
40%~50%的子宫内膜癌患者的宫颈脱落细胞可检测到子宫内膜癌细胞，这让使用脱落细胞进行内膜癌甲基化早期诊断具临床可行性。通过宫颈口脱落细胞检测子宫内膜癌，PCDHGB7甲基化对早期（Ⅰ期）子宫内膜癌诊断的敏感性为85.71%，特异性为80.60%，目前基于该基因的检测产品已获得欧盟CE认证。CDO1和CELF4甲基化检测的敏感性和特异性分别为87.5%和90.8%，BHLHE22/CDO1/HAND2的敏感性和特异性分别为87.0%和86.0% 。卫生棉条收集阴道样本与医师采样可达到一致的DNA甲基化检测水平。国内外研究与专家建议，推荐子宫内膜癌DNA甲基化筛检临床路径：⑴影像学联合甲基化筛检；⑵生殖道出血分层管理；⑶子宫内膜癌高风险人群筛查。
血液中的DNA甲基化标志物可以在癌症发生早期被检测到，且伴随癌症发展和治疗过程。国内外已经有大量的研究在不同癌种中对血液检测DNA甲基化标志物进行探索，以期能够辅助癌症诊断。
原发灶不明恶性肿瘤（carcinoma of unknown primary，CUP）是一类经病理学诊断为转移性恶性病灶，但是经过常规检查和评估仍不能确定原发部位的异质性肿瘤，占全部肿瘤病例的3%~5%。越来越多的研究证据表明通过对肿瘤甲基化状态的检测，可以实现对肿瘤原发部位的溯源。FERNANDEZ等通过对1 628例肿瘤患者组织标本的甲基化图谱分析，鉴定并识别出 24 种肿瘤特异性的甲基化改变模式，能用于CUP的肿瘤类型溯源。MORAN等构建的基于组织DNA甲基化谱的肿瘤类型分类器（EPICUP）在7 691个肿瘤的验证集中显示出99.6%的特异性和97.7%的敏感性，DNA甲基化谱预测了216例CUP患者中的188例（87%）的原发来源。ZHU等利用组织特异性单细胞RNA测序数据集构建了一个定义为13种实体组织类型和40种细胞类型的DNA甲基化图谱，结果显示该图谱能够正确地预测不同肿瘤类型的起源细胞。
cfDNA甲基化已被证明是非常有前途的特征性标志物，不仅能检测癌症，还能定位其组织来源。一项针对cfDNA的测序分析技术在肿瘤早筛中的临床研究，准确预测了75%（95/127）肿瘤样本的组织信号来源。还有研究开发了组织特异性DNA甲基化标志物，其中肝源性DNA绝对浓度为能更好地区分结直肠癌肝转移患者和无肝转移患者。STACKPOLE等开发了基于cfDNA的肿瘤溯源方法并应用于408例结肠癌、肝癌、肺癌和胃癌患者及对照组，在97.9%的特异性下，检测全期和早期癌症的敏感性分别为 80.7% 和 74.5%，溯源全期和早期癌症的准确率分别为89.1% 和 85.0%。
MGMT启动子区域甲基化水平可用于评估脑胶质瘤对替莫唑胺的敏感性，启动子甲基化阳性的患者对替莫唑胺的敏感性高于甲基化阴性的患者。RASSF10基因甲基化可能是肝癌对多西他赛耐药的标志；QPCT启动子区域的甲基化程度及QPCT 的表达水平可以作为预测肾癌对舒尼替尼敏感性的生物学标志物；p16甲基化是预测胃癌对阿贝西利（Abemaciclib）敏感性的潜在标志物；TROP2 甲基化可预测乳腺癌对他莫昔芬耐药；ERCC1和MGMT基因甲基化可作为结直肠癌患者对 FOLFOX 反应的预测标志物；HSP70甲基化通过与BCL2 mRNA 结合使其稳定，导致胰腺癌细胞对治疗产生耐药。
随着生物信息学的进步和cfDNA甲基化检测技术的不断成熟，目前已经建立了癌症特异性甲基化模式，使通过检测cfDNA甲基化（血液或其他体液）进行动态监测药物反应成为可能在接受新辅助化疗和/或手术的非小细胞肺癌中，RASSF1A和RARβ2甲基化会下降到健康受试者水平，提示动态检测DNA甲基化水平可以监测其治疗反应。在接受顺铂化疗的肺癌患者中，24 h内APC和/或RASSF1A甲基化水平增加与总生存期（overall survival，OS）增加相关。临床观察发现，对化疗和（或）放疗有反应的晚期肺癌患者在开始治疗后7~10 d内血浆中SHOX2甲基化水平下降，且治疗前和治疗后7~10d的高SHOX2甲基化水平与较短的OS相关。在妇科肿瘤中，通过检测cfDNA中MLH1的甲基化水平可预测卵巢癌患者对铂类药物的敏感性；通过检测HOXA9和RAD51C基因的甲基化水平可预测PARPi的治疗效果；而检测KANSL1甲基化水平可预测卵巢癌的免疫治疗疗效。
经手术或治疗后的MRD是肿瘤复发的主要原因。DNA甲基化标志物用于MRD分析时不需要获得原发肿瘤特征性的突变信息，其灵敏度不依赖于患者高频突变数量，对MRD检测具有很大的潜力。目前，已有证据证实DNA甲基化标志物可应用于MRD检测，以此识别术后高复发风险人群，以筛选辅助治疗获益人群，避免复发低风险患者承受过度的治疗。
基于LUNAR-1研究结果，利用ctDNA突变联合ctDNA甲基化对结直肠癌患者进行MRD检测及复发监测，与单独ctDNA突变相比，整合ctDNA甲基化分析的敏感性提高25%~36%。一项前瞻性Ⅱ~Ⅲ期临床试验（注册号：NCT00958737）纳入805例结直肠癌患者分析了手术前后血浆样本中ctDNA甲基化标志物（WIF1和NPY）评估MRD与肿瘤复发的关系，发现ctDNA阴性组2年无病生存率明显高于ctDNA阳性组（82% vs 64%）。另一项Ⅱ~Ⅲ期回顾性研究纳入87例乳腺癌患者，经新辅助化疗后，患者血浆中ctDNA基于RASSF1A启动子的超甲基化（met-ctDNA）水平与残余肿瘤负荷程度显著相关（P=0.008）；同时，术后1年met-ctDNA阳性患者中（7例）有3例出现肿瘤复发，而met-ctDNA阴性患者均未出现。
cfDNA较短的半衰期使其与肿瘤细胞演进状态密切相关，也使其用于肿瘤复发的动态监测成为可能。在一项肝癌的大队列临床数据研究中，通过整合全基因组甲基化水平、临床大数据分析和机器学习，建立了含有8个甲基化标志物的肝癌预后预测模型，生存曲线显示高风险组生存率均明显低于低风险组，且该预测模型对预后的评估能力优于临床分级。类似地，基于ctDNA甲基化标志物的机器学习算法用于CRC患者的预后判断研究发现，治疗后肿瘤残留患者及复发患者的评分较高，此外预后预测模型还能有效预测CRC患者的预后和生存期。还有一项针对Ⅰ~Ⅲ期CRC的多中心、前瞻性队列研究纳入了299例患者，分析手术前、手术后、辅助化疗时及化疗结束后血浆中6种ctDNA甲基化标志物水平，结果发现术后1个月ctDNA甲基化阳性患者的复发风险是阴性患者的17.5倍，而且该甲基化检测提示复发转移早于影像学证据，中位期提前3.3个月。在CRC中，cfDNA甲基化标志物结合血清CEA构建评分体系可在临床或影像学发现复发灶之前预测复发，提前的中位天数为106 d（范围：90~232 d）。在前列腺癌患者中，多西他赛治疗两个周期后检测不到血清GSTP1甲基化的患者生存时间更长，提示血清游离 GSTP1 甲基化可能是一种有潜力的临床试验替代终点和临床决策工具。
癌症是全球死亡的主要原因之一，对癌症的“早发现、早诊断、早治疗”可以降低所有类型癌症的死亡率。目前，表观遗传学领域的研究正处于蓬勃发展之中，其中DNA甲基化标志物的研究尤为突出，其研究方向包括：⑴深入探讨DNA甲基化的调控机制，研究不同甲基化状态下肿瘤的发生、发展以及对治疗的耐药性差异，为后续DNA甲基化标志物的开发提供更加扎实的理论依据；⑵在技术层面，致力于开发新型甲基化转化、甲基化检测技术和方法，以提升检测的特异性和敏感性，并且为临床应用铺平道路；⑶开发组合的生物标志物，将多种DNA甲基化标志物结合或与其他类型的生物标志物结合使用，最终构建更可靠的生物标志物模型；⑷利用机器学习和深度学习算法对DNA甲基化数据进行预测分析，构建复杂的算法和模型，从海量的甲基化数据中识别出具有诊断或预后意义的甲基化标志物。本专家共识全面梳理了DNA甲基化标志物的检测技术、临床应用及其在肿瘤管理中的潜力，提出了一系列具有前瞻性和实践指导意义的共识推荐。未来，期待本共识进一步落地和实践，为患者的健康保驾护航，为医学领域发展贡献更多的智慧和力量。
引用本文
中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会. 肿瘤DNA甲基化标志物检测及临床应用专家共识（2024版）［J］. 中国癌症防治杂志, 2024, 16(2): 129-142.
作者：中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会
