传统获取肿瘤患者组织样本的活检方法主要为穿刺活检，穿刺活检的局限性在于：穿刺活检的创伤大、重复取样不方便、穿刺自身的临床风险等。传统活检的局限性限制肿瘤精准化医疗的进程，包括无法便利地实现肿瘤的实时监测、无法实现肿瘤的早期诊断等。液体活检是指从血液中捕捉自由游走的癌细胞或癌细胞中的DNA，以获得关于小肿瘤或潜藏肿瘤的信息，从而对癌症等疾病做出诊断，如果配合传统检测技术，更具有临床指导意义。
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液体活检目前包括循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）碎片、循环RNA（Circulating RNA）和外泌体（携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、RNA等）等主流技术。相比于传统检测手段，液体活检具有微创、可重复进行的特点，可实时监测肿瘤治疗的疗效和肿瘤的进展。
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循环肿瘤细胞是外周血中所有肿瘤细胞的统称，因自发或者诊疗手段从实体瘤肿瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落进入外周血循环。大量临床研究表明，对CTC数量进行跟踪、监控有助于癌症早期诊断，预后判断和药效评估。ctDNA是肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，是特征性的肿瘤生物标志物。循环肿瘤DNA检测技术近年来正逐渐成为国际上具有重大潜力的肿瘤诊断新技术。
研究者很早便在肿瘤患者的血液中检测到CTCs，并且发现在肿瘤发生早期即有循环肿瘤细胞通过血液循环发生全身扩散的现象，开启了研究热潮。1948年，科学家便在人类血液中检测到cfDNA的存在，但是早期并未受到较多重视。然而，早期的研究以基础研究为主，很少有对应的专利布局。1977年，科学家发现肿瘤患者外周血中存在较高水平的cfDNA，其后肿瘤患者血液循环中的cfDNA受到了研究重视。ctDNA是坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到外周血中的肿瘤DNA片段，被包含于cfDNA中，是肿瘤患者cfDNA中的一部分。近年来，ctDNA的相关检测技术受到了重视，其重点是针对主要瓶颈加以开发：一是ctDNA在血液中的浓度低；二是ctDNA易被其他更高浓度的循环DNA干扰；三是肿瘤细胞的基因变异（包括点突变、删除、插入、扩增、DNA修饰等）信息复杂，已知信息不全面，从而使得检测的灵敏度及准确率受到限制。在此情形下，针对ctDNA的富集成为专利布局的重点，包括用于稳定循环肿瘤细胞的组合物(CA2917912)、循环肿瘤细胞分析中假阳性识别(WO2015161231)、用于检测和分离循环肿瘤细胞磁性纳米结构(US20180059114)等。同时，许多用于CTCs的检测技术得到了开发，例如密度梯度分离技术、基于尺寸的过滤技术、基于免疫的分离技术、免疫磁分离技术(CN107858144)等，通过细胞的物理性质（例如大小、密度、电荷、变形性等）(JP6535050、US20110294206)或生物特性将其与正常细胞分开。以CTC、cfDNA、外泌体等肿瘤液体活检，被列为2015年十大突破技术之一，进一步加速了专利布局的热潮。就循环肿瘤细胞的分析技术而言，肿瘤分子标志物的检测是基础的方法，但是CTC单细胞基因组测序能够读取单个循环肿瘤细胞特异性信息，发展潜力巨大。对于异质性很强的肿瘤，CTC相比组织单一取材，更能全面反映肿瘤组织的异质性，更适合于评估肿瘤的分子特征及评估肿瘤进展。因此，一些特定的标志物相关专利得到了布局（例如US10234447、EP2529030等）。常见的循环肿瘤细胞分子标志物及其检测应用如下图1所示。
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图1、常见的循环肿瘤细胞分子标志物及其检测应用
综合专利分析表明，全球有诸多的专利权人布局循环肿瘤细胞的分离和鉴定，这些布局基于不同的原理加以开发：①基于细胞大小不同，如英国ANGLE公司开发的名为Parsortix的新型细胞捕获技术；②基于免疫的富集技术，如美国强生公司开发的计数分析循环肿瘤细胞Cel1 Search系统，其是全球第一个经过FDA(2004年获批)和原国家食品药品监督管理总局(2012年获批)批准用于恶性肿瘤疾病管理的检测循环肿瘤细胞的商业化产品；③基于成像技术的平台，如不需要富集的FASTcell,利用光纤扫描，优点是减少曝光时间，因为它使用了激光光源和光电倍增管检测器。不过，缺点是高速成像有可能降低分辨率。分辨率较低会影响准确性，因此需要通过显微镜来确认；④其他平台，如基于细胞介电性质的双向电泳技术，目前商业化的双向电泳技术主要有ApoCell公司的ApoStream、SiliconBiosystems公司的DEPArray。![]()
图2、循环肿瘤细胞分离和鉴定的专利权人技术分类
常见的循环肿瘤细胞分离方法及其优缺点如图3所示。从专利发展历程和布局现状来看，循环肿瘤基因检测技术专利在以下方向呈现出发展的新空间。
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图3、常见的循环肿瘤细胞分离方法及其优缺点
血液中循环肿瘤细胞含量极低，如何富集成为关键技术。在加速循环肿瘤基因在临床实践中的应用，结合富集和检测技术的自动化检测系统已被用于提高检测的灵敏度和特异性。例如，采用纳米级免疫磁性平台，或可用于快速、高效捕获以及温和释放循环肿瘤细胞。就目前的循环肿瘤细胞的捕获和分离技术而言，细胞表面标志物有很多种，如根据标志物类型来分，有上皮细胞标志物（上皮细胞黏附因子和细胞角蛋白）、器官特异性标志物、上皮细胞转化(EMT)标志物；根据抗体类型来分，有单一抗体、“鸡尾酒”、复合物（抗体-多核酸复合物、生物素标记的抗体、氨基化树状分子）；根据策略类型来分，有免疫磁珠、免疫细胞化学、微流控等（如图4所示）。
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图4、循环肿瘤细胞的捕获和分离技术原理分类
尽管基于上皮细胞标志物的捕获技术仍然是“金标准”，但是很难找到灵敏性和特异性兼顾的生物标志物，因而假阳性和假阴性的局限仍然难以避免。可能用于循环肿瘤细胞检测的常见分子标志物如图5所示。
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图5、可能用于循环肿瘤细胞检测的常见分子标志物
存在于血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液等体液中的循环肿瘤RNA(circulating cell-free RNA, cfRNA)，也已逐渐成为新兴的液体活检分子标记。与传统分子诊断技术相比，基于cfRNA的液体活检能够克服肿瘤的异质性，更全面地反映肿瘤特性，并具有非侵入性，便于多次取样，可对患者进行实时监控。目前在基因融合突变检测中常用的染色体显带技术、荧光原位杂交、免疫组化只能用于检测染色体或组织细胞(无法适用于cfRNA)，荧光定量PCR需要标准曲线确定待测样本的拷贝数（无法检测到cfRNA中的稀有突变)，高通量测序方法的读长较短，测序结果并不精准。因而，针对样本丰度低、半衰期短的cfRNA，需要开发新的基因融合突变检测方法。肿瘤循环细胞作为生物标志物，在筛查、药物评价、预后等方面也有着广泛的应用前景（如图6所示），未来也有较广阔的专利布局空间。
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除了血液外，粪便既含有脱落的正常结直肠上皮细胞和游离的DNA，也含有从结直肠癌上脱落的特别浆细胞和肿瘤DNA。由于肠道是碱性环境（有利于DNA保存），从粪便中提取的DNA作为无创性结直肠肿瘤标志物，在研究中得到了应用。
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