免疫法是基于抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应所建立的分析法。
抗原抗体反应的特点主要有四个:特异性、比例性、可逆性,阶段性。
特异性是抗原抗体反应的最主要特征,这种特异性是由抗原决定簇和抗体分子的超变区之间空间结构的互补性确定的。
抗原抗体特异性结合
抗原
抗体
比例性是指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系,只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应,在抗原抗体比例相当或抗原稍过剩的情况下,反应最彻底,形成的免疫复合物沉淀最多、最大。而当抗原抗体比例超过此范围时,反应速度和沉淀物量都会迅速降低甚至不出现抗原抗体反应。
抗原抗体反应
阶段抗原抗体反应可分为两个阶段,第一个阶段为抗原抗体的特异性结合阶段,此阶段是抗原与抗体间互补的非共价结合,反应迅速,可在数秒钟至数分钟内完成,一般不出现肉眼可见的反应现象。第二个阶段为可见反应阶段,是小的抗原抗体复合物间靠正、负电荷吸引形成较大复合物的过程。此阶段反应慢,需要时间从数分钟、数小时至数日不等,且易受多种因素和反应条件的影响 。
可逆性是指抗原抗体结合形成复合物后,在一定条件下又可解离恢复为抗原与抗体的特性。由于抗原抗体反应是分子表面的非共价键结合,所形成的复合物并不牢固,可以随时解离,解离后的抗原抗体仍保持原来的理化特征和生物学活性。
免疫比浊法是指当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时,形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂(聚乙二醇等)的作用下,自液相析出,形成微粒,使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时,形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加,反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照,即可计算出样本中抗原的含量。
免疫比浊法按光路分为免疫透射比浊法和免疫散射比浊法。
抗原抗体结合后,形成免疫复合物,在一定时间内复合物聚合出现浊度。当光线通过溶液时,可被免疫复合物吸收。免疫复合物量越多,光线吸收越多。光线被吸收的量在一定范围内与免疫复合物的量成正比。
一定波长的光沿水平轴照射,通过溶液时遇到抗原抗体复合物粒子,对光线形成折射,发生偏转,光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关。散射光的强度与复合物的含量成正比,即待测抗原越多,形成的复合物也越多,散射光也越强。
胶乳免疫增强法:胶乳增强免疫比浊法是后来出现的一种较为稳定、准确的免疫比浊衍生技术,其原理是将待测物质相对应的抗体包被在胶乳颗粒上,使抗原抗体结合物的体积增大,光通过之后,透射光和散射光的强度变化更为显著,从而提高试验的敏感性。
普通免疫比浊法
胶乳免疫比浊法
符号注释
常见干扰因素
1. 脂血:脂血样本中含有大量乳糜颗粒,乳糜颗粒具有光散射的特性,会产生浊度;
2. 黄疸:胆红素及其衍生物在特定波长下产生的本底干扰,胆红素遇光和热不稳定,易生成胆绿素、胆褐素等衍生物;
3. 溶血:血红蛋白本身吸光度的干扰;
4. 内源性干扰物质:RF、嗜异性抗体、人抗动物抗体、自身抗体、M蛋白等;
5. 标本离心不彻底和反复冻融;
6. 试剂落入灰尘;
7. 稀释杯或比色杯不干净;
8. 钩状效应:在抗体量恒定的溶液中加入抗原,免疫复合物的生成量随着抗原量的增加而增加,当达到峰值之后,则随着抗原量的增加而减少;