空间转录组实验你必须知道的那些事
文摘
2024-10-31 09:00
北京
10x Visium 空间转录组的技术工作原理是基于一种特殊化设计的载玻片完成样本捕获，从而空间位置标记的探针与细胞释放的 RNA 杂交，载玻片上原位完成反转录合成 cDNA，收集 cDNA，最后进行测序文库构建。- 一个载玻片可容纳4个切片(捕获区域)，制备4个文库；
- 每个6.5mm x 6.5mm 捕获区域, 有5000个 barcode 标记的 ST 位点；
- 通过 Poly T 捕获带有 PolyA 的 RNA，利用独特的空间 barcode 进行空间位置标记
10x Visium 的实验流程从新鲜组织处理开始，新鲜组织先进行速冻包埋和冷冻切片，将切片贴在基因表达芯片的捕获区域，进行 H&E 染色拍照，记录组织切片的组织学形态信息。然后进行组织透化，使细胞中的 RNA 释放出来并被芯片上的 poly T 探针捕获。逆转录反应合成 cDNA 并引入 spatial barcode 和 UMI。合成二链 cDNA 之后转移到 EP 管中进行文库构建，最后进行文库测序和分析。在进行正式的基因表达文库实验之前，推荐利用 10x 官方提供的组织优化试剂盒（Visium Spatial Tissue Optimization Kit）进行样本通透化时间的测试以确定最佳透化时间。组织优化实验流程展示如下：![]()
组织优化的玻片没有 spatial barcode，最终得到的结果是 cDNA 荧光足迹图片。我们根据 cDNA 荧光足迹图片选择最佳的透化时间。10x空间转录组文库，采用 Illumina Hiseq PE150 或 NovaSeq PE150 测序策略，推荐每个位点（spot）测50,000-100,000 reads，即每个样本（5000个spots）测75-100G 数据量。测序深度与样本在载玻片上捕获区域的覆盖面积和样本类型及复杂度有关，适当加大测序数据量可提高基因的检出率。RNA样本的质量评估对于成功完成RNA测序工作流程中的文库制备，以及后续高通量测序实验的准确性至关重要，RNA分子越完整，则与空间转录组探针结合的几率就越高。由于样本自身的特点，针对新鲜冷冻组织和FFPE空转样本有着不一样的RNA质检标准。新鲜冷冻组织主要是以RIN值来衡量样品中抽提的RNA质量。RIN值，即RNA integrity number（RNA完整值），是使用Agilent 2100生物分析仪对RNA进行分析，基于整体电泳图，将真核生物总RNA质量分类，并设定RIN数值范围为1-10，其中1代表RNA降解较为严重，10代表RNA完整性较高。注：一般切取10片组织切片进行RNA抽提并质检，建议使用RIN值＞7的样本进行Visium空间实验。![]()
FFPE样本由于RNA降解，从中提取RNA样品进行文库制备具有一定挑战性，因此需要针对FFPE文库制备采用定制方案。DV200即超过200个核苷酸的RNA片段的百分比，DV200值越高，表明RNA分子的完整度越高，与空间探针的结合概率也更高。如下图所示不同组织部位的FFPE样本提取RNA的RIN值一般较小（多集中在2.0左右），但是其DV200值相差较大，更能反映RNA的实际降解程度。![]()
不同FFPE样本RIN值和DV200检测（引自Illumina官方）研究发现DV200与FFPE样本的捕获前文库产率表现出高度关联性，因此将DV200作为评估FFPE样本RNA质量的可靠参数。注:一般切取5-10片FFPE组织切片进行RNA抽提并进行DV200检测，建议使用DV200＞50%的FFPE样本进行Visium实验。FFPE样本DV200检测（图片引自10x官方）
无论是新鲜冷冻组织样本还是FFPE样本，都需要通过普通HE染色，选择组织形态的完整性较好的切片，并与客户及时进行确认。FFPE空间转录组是基于靶基因的探针杂交进行的转录组测序，因而不需要进行组织透化。针对新鲜冷冻组织样本，建议每个样本都做组织优化预实验，尤其是临床样本。组织优化的目的就是摸索适合特定样本的组织透化条件，保证组织切片中的mRNA能够充分释放。1.选择目标区域附近的组织切片，在没有空间条形码的玻片上进行固定和染色；3.捕获mRNA，然后用带有荧光的核苷酸进行反转录合成cDNA。4.酶处理移除样本组织，然后对带有荧光标记的cDNA进行成像。5.对比H&E和荧光成像，选择荧光信号较强、RNA弥散较小、内部组织结构清晰的时间点，作为正式实验透化时间点。![]()
Q1：不行，组织透化实验所用的玻片上有探针，但是没有空间条形码(barcodes)，不能进行后续空间实验。A2：组织优化实验所用的贴片，还能取下用做正式实验吗？Q2：不行，组织内RNA已经透化并被探针捕获，并且组织已被酶移除。Q3：不可以，样本贴片后和玻片紧密地粘附，无法完整地取下，强行取下切片后会使spot点上的引物脱落，影响实验的准确性。Q4：根据不同的组织样本，会进行切片厚度调整10-20μm，再进行正式实验，FFPE样本一般切片厚度为5μm。A5:较小的组织块，多个包埋在一起可以进行实验吗？Q5：较小的组织可尝试多个组织包埋在一起，但组织间隔尽量小，且不要重叠，多个组织保持在一个水平面，厚度满足1mm以上即可（风险提示：多个组织在同一个包埋块，切片透化都有风险，每个区域透化参数有一定差异，需要取舍筛选适合区域）。A6:动物组织样本中，例如骨组织样本，由于其切片碎片较多，钙质高，容易发生脱片；而植物切片样本中由于其本身含有较多纤维，并且某些部位可能淀粉含量过高，会导致粘着性较低，发现脱片现象。![]()
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