直接检测依赖于核酸自身与某些电极之间能发生直接的电子转移，DNA的一些组分包括核糖和碱基在一定的电势下具有电化学活性。 间接检测是利用一些电化学活性媒介来进行电子传递，借助这些电化学活性指示剂与DNA选择性的结合来实现杂交检测。
1、基于电化学活性指示剂的杂交检测
电化学活性杂交指示剂能通过不同的方式与核酸分子发生相互作用，根据结合方式和结合力的不同，通过测定其氧化还原峰电流和峰电位就可识别和检测目标分子。
在选择插入指示剂的方式时，一般要求指示剂与双链的结合能力远大于与单链的结合能力，这样才能获得较高的检测灵敏度。
这一类的传感器通常是将杂交反应后的电极浸入含有电化学活性杂交指示剂的溶液中反应一定时间；或在杂交反应之前，先加入电化学活性分子再进行杂交，然后进行电化学检测，所得信号的大小或变化值可以反映电极表面dsDNA的多少，从而测定被测溶液中目标DNA片段的含量。
指示剂与核酸分子的结合方式包括静电结合、亲水/疏水结合，插入到碱基中，或者以独特的化学结构嵌入到核酸双螺旋结构的沟槽中（常用的杂交指示剂主要有蒽环类的抗生素、染料、金属配合物等）。
图1. 电活性物质嵌入型DNA传感器
电化学活性杂交指示剂通过其与单链和双链核酸分子选择性结合产生的电化学电流的差异来实现杂交检测，该类检测方法无需对核酸探针或者目标核酸进行电化学活性信标修饰，具有操作简单、分析速率快的优点。但是，由于该类指示剂还不能对单链或双链核酸表现出单向的结合亲和性，同时，指示剂本身可以通过自由扩散在基底电极表面发生电化学反应，因此，该类检测方法常常存在较高的背景电流而影响传感体系的检测限。
2、基于酶联反应的信号放大检测
为了提高电化学核酸传感器的灵敏度，有效地区分低目标核酸浓度下的杂交信号与背景信号，有必要使用适当的方法对杂交信号进行放大，以酶分子作为信号分子进行放大是电化学核酸传感器常用的方法之一。
酶分子利用酶的催化作用，可以将酶底物大量转化为电化学活性产物，即一个酶分子可以产生多个信号电子，从而可以得到放大的电化学信号，与电化学活性小分子信号转换的设计类似，酶分子也可通过共价修饰于核酸探针末端，然后通过夹心杂交或者构象变化策略实现杂交信号的放大转换。例如，Liu等设计了一个基于发夹形核酸探针和酶催化信号放大的电化学核酸传感器。末端修饰地高辛单元(Digoxigenin,Dig)和生物素分子(Biotin)的发夹核酸探针通过生物素-亲和素(Biotin-Avidin)结合固定于金电极表面，自由状态下核酸探针的发夹构象使末端的地高辛单元深埋在核酸分子层内部，无法结合抗地高辛标记的辣根过氧化酶；当存在目标核酸时，目标核酸与发夹探针杂交导致发夹环被打开，形成双螺旋结构，使核酸探针末端的地高辛单元暴露于电极表面，暴露的地高辛单元可捕获抗地高辛标记的辣根过氧化物酶，将其固定于电极表面。电极表面固定的酶分子催化过氧化氢，将四甲基联苯胺(TMB)氧化，氧化产物进一步在基底电极表面被电化学还原而产生一个放大的电流信号。通过此酶催化放大信号转换，传感器对目标核酸的检测限可达到fmol量级。
图2. 酶放大电化学核酸传感器
3、基于纳米材料的信号检测
随着纳米技术的发展，具有优良生物相容性、高比表面积、良好化学稳定性、催化性及导电性等优越性能的纳米材料被广泛地用于生物传感器界面的构建。纳米材料的使用可大大提高传感器的分析性能，有效放大检测信号，且具有稳定识别探针或生物传感界面的作用。目前，金属纳米粒子、量子点、碳纳米材料、磁性纳米材料等都已用于核酸传感器的构建。
在众多纳米材料中，金纳米材料是各领域应用得最多的纳米材料之一。近年来，金纳米材料在生物传感方面的应用也已经成为研究的热点及焦点。利用金纳米颗粒与DNA探针，结合各种电化学方法和技术，一系列快速、操作简单、成本低廉的电化学分析新方法已经被发展，实现了对金属离子、DNA、蛋白质和细胞等的高选择性、高灵敏度的检测。
作为电化学分析的标记物，许多标记在金纳米颗粒上的生物分子能够保持其活性并选择性结合对应物质，然后通过对纳米金的分析来实现对目标物的检测。由于纳米金有独特的电子电化学性能，它不仅是识别核酸分子固定在电极上的一个有效可利用工具，而且还是对杂交反应发出信号的标签。目前，已经发展了各种基于金纳米颗粒的电化学核酸检测方法，例如，Cai等在电极表面组装巯基修饰DNA作为识别分子，通过DNA将金纳米粒子组装到电极表面，并负载大量硫堇，修饰硫堇后的电极表现极强的电化学氧化还原峰。当目标DNA被引入后，识别DNA与其杂交，形成双链，能被核酸内切酶剪切，此时负载了硫堇的金纳米粒子从电极表面脱落，硫堇的电化学氧化还原峰将显著降低。结合聚合酶链反应(PCR)的放大作用，该传感器对丙型肝炎病毒基因型1b(HCV-lb)的最低检测限可低至3.1×10^-22mol/L。
图3. 金纳米颗粒结合限制性内切酶的信号放大核酸电化学传感器
随着纳米材料的不断发展，应用于生物传感器的纳米材料有向更环保、生物相容性更好的碳纳米材料发展的趋势。碳纳米材料具有一系列特殊的物理性质和化学性质，如碳纳米管和石墨烯等，有较大的比表面积、几乎可以忽略的热膨胀系数和很好的热稳定性、化学稳定性及传热导电性能。
在生物传感研究中，利用碳纳米材料能负载更大量的信号分子、有效增加电极比表面积、能极大地降低过电位并加快电子的传递，可实现对传感器响应信号的放大，加上良好的导电性能和电催化性能，使碳纳米材料在生物传感器领域具有了十分广泛的应用。例如，Wang等利用碳纳米管的显著信号放大作用，实现了蛋白质和DNA高灵敏电化学检测。在这个传感设计中，一方面碳纳米管对玻碳电极表面的修饰能够很好地加速电子传导；另一方面，利用碳纳米管作为载体，将碱性磷酸酶修饰到碳纳米管上作为识别元，能够极大提高识别事件的信号输出，基于这个设计的多重信号放大作用，该传感器具有非常低的检测限。
4、基于核酸体外扩增技术的信号放大检测
滚环扩增技术(RCA)是一种线性等温扩增技术，基本原理是以环状DNA为模板，通过一段DNA引物与其互补杂交，在DNA聚合酶的催化作用下将dNTPs沿模板序列转化成DNA单链，最后得到的单链DNA含有大量与环形模板互补的重复片段。该方法不仅可实现对核酸分子的扩增，也可以对目标分子进行信号放大，由于具有反应条件简便、反应速率快、高灵敏性和易操作性，使得它在高通量的DNA诊断和蛋白质分析过程中有广泛的应用。
Huang等使用黄曲霉毒素A(OTA)的特殊适配子作为识别探针，设计了基于滚环扩增技术提高电化学信号的核酸传感器来检测OTA。在他们的传感器中，扩增引物被设计为两部分，其中一部分序列定向针对OTA的适体序列，而另一部分是与电极表面的捕获探针互补的序列，以亚甲基蓝(MB)作为电化学氧化还原指示剂，当存在OTA时，原先与锁状模板杂交的引物会被替换下来，转而与黄曲霉毒素A(OTA)作用，若进行滚环扩增反应(RCA)，扩增产物与电极表面的捕获探针作用，此时，亚甲基蓝(MB)的氧化还原信号较强；反之，若不进行滚环扩增反应(RCA)，没有扩增产物与捕获探针作用，亚甲基蓝(MB)的氧化还原信号相对要低很多，这种设计可大大提高检测的灵敏度，结果显示，传感器的检测限达0.065pg/mL，大大低于原先报道的检测浓度。
图5. 基于滚环扩增放大信号的电化学检测OTA原理
核酸外切酶是一种能够识别特殊的碱基序列或者特异的功能团从单链或者双链核酸分子的一端对核酸碱基进行逐一降解的酶。尽管大多数核酸外切酶对目标序列的特异性要求不高，但仍有一些核酸外切酶在识别DNA末端具有很强的专一性，如核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)和λ外切酶（λExo)等。
在一些研究中，基于这些核酸外切酶的酶切循环信号放大方法已被用于构建高灵敏的核酸传感器。例如，Xuan等设计了一种利用分子信标和ExoⅢ的高灵敏核酸电化学传感器。他们设计合成了一条3’端为突出端且有亚甲基蓝修饰的分子信标，将其修饰于电极表面，由于分子信标具有较大的分子量和较多的负电荷，使电化学活性物质远离电极表面，此时只有很小的电信号；当目标DNA与分子信标杂交后，发夹结构打开并引发ExoⅢ进行循环酶切，亚甲基蓝基团被切下后靠近电极表面，此时会产生增强的电信号，从而实现对目标分子的检测。
图6. 基于核酸外切酶放大的传感器原理
参考文献：
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