Industrial Crops & Products | 冷冻保护剂诱导的欧洲云杉胚性愈伤组织渗透胁迫响应的分子机制
文摘
科学
2023-02-25 18:54
北京
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超低温保存是一种经济、可靠的长期保存植物种质资源的关键技术。山梨醇、DMSO是被广泛使用的植物细胞冷冻保护剂，而关于保护剂在超低温保存预处理(CPT)过程中诱导的渗透胁迫响应机制尚不清楚。本研究使用不同浓度山梨醇、DMSO组合的CPT处理欧洲云杉(Picea abies (L.) Karst.)胚性愈伤组织(ET)，发现CPT可提高ET溶液热稳定性，但处理间复性生长量差异显著。选择有代表性的T3、T6(两种溶液热稳定性相似但复性生长量差异大的CPT)做进一步研究，发现该两种CPT均能诱导ET细胞周期由G1向G2期转移，处理间细胞活性差异大。利用Illumina测序平台对T3和T6处理过程(未经CPT为对照、T3/T6处理4、24、48 h及添加DMSO为处理组样品)的27个样本进行RNA-seq，分析发现冷冻保护剂诱导的早期(4 h)分子响应十分关键，WGCNA 结果表明PaMYB11是关键模块的hub基因之一，可能在该过程中发挥重要作用。因此，本研究进一步创制欧洲云杉PaMYB11 RNAi细胞系，证实了PaMYB11上调表达是ET在CPT过程存活的必要条件。本研究为欧洲云杉ET应对CPT诱导的渗透胁迫分子响应机制提供了新的认识，也为开发更有效的针叶树体胚材料超低温保存方法、进一步扩大其产业化应用提供了思路。
主要结果1：CPT增强欧洲云杉ET细胞溶液热稳定性经由差示扫描量热法检测，与对照(CT)相比，CPT处理后的ET溶液热焓值显著下降，根据溶液热焓值越高，溶液热稳定性越差，说明欧洲云杉ET经由冷冻保护剂处理可增强溶液热稳定性(图1)。
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图1 欧洲云杉ET不同CPT处理后的DSC热特征曲线主要结果2：有效的CPT可使ET细胞避免大规模坏死 FDA/PI双染检测显示，与CT相比，T3处理后FDA绿色荧光显著降低，表明其细胞活性显著下降，而T6细胞活性无明显变化，说明经由高效的CPT处理可更好地维持细胞活性(图2)。![]()
图2 T3和T6处理后欧洲云杉ET细胞活性及冻存后复性生长
主要结果3：CPT诱导ET细胞周期由G 1向G2转移 流式细胞仪检测T3、T6处理后的ET细胞周期，T3和T6处理后G2期细胞比例由CT的2.44%显著增加到7.65%和8.68%，说明冷冻保护剂处理可诱导ET细胞周期由G1向G2转移(图3)。![]()
图3 欧洲云杉ET不同CPT处理细胞周期分析
主要结果4：ET在高效CPT早期(T6-4)发生更强的生理响应 取CT对照，T3、T6处理过程中的27个样本进行RNA-seq检测，PCA分析显示T6-4与其他样品分离，T3-4与CT聚集。此外，CT vs. T6-4 差异基因(DEG)数量是CT vs. T3-4的近2倍。说明 ET经T6-4处理在转录水平响应更强烈。GO富集分析显示细胞壁修饰相关生物过程在所有比较组均显著富集(图4)。![]()
图4 欧洲云杉ET T3和T6处理过程RNA-seq分析
主要结果5：PaMYB11是T6早期(4 h)响应模块hub基因之一WGCNA分析显示，全部DEG划分为18个表达模式，本研究关注T6-4高表达的darkorange模块，PaMYB11是该模块hub基因，报道与细胞壁修饰相关，且在整个CPT过程中PaMYB11在T6的转录水平始终显著高于T3(图5)。![]()
图5 欧洲云杉ET T3和T6处理过程DEG的WGCNA分析
主要结果6：PaMYB11上调表达对ET在CPT过程存活是必要的为明确PaMYB11功能，本研究创制1个转化空载，2个PaMYB11 RNAi细胞系，并对转化细胞系及野生型对照进行T6处理、超低温保存、复性生长，结果发现T6处理后野生型、空载细胞系细胞活性较CPT处理前无明显变化，而35S:PaMYB11i.3和35S:PaMYB11i.5细胞系几乎检测不到活细胞，且两个RNAi细胞系均无法恢复生长。结果证实CPT过程缺少PaMYB11的分子调控，ET细胞难以存活(图6)。![]()
图6 PaMYB11 RNAi和对照细胞系T6处理后细胞活性及冻存后复性生长
研究结果以题为"Integrated
transcriptome and physiological analysis reveal the molecular mechanism of the
osmotic-responses induced by cryoprotectants in Norway spruce embryogenic
tissue"在线发表于Industrial Crops
& Products，中国林业科学研究院林业所博士研究生胡继文和林木遗传育种国家重点实验室朱天擎助理研究员共同为该论文的第一作者，林业所王军辉研究员为论文通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金委员会青年科学基金(Grant no. 31901288)和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(CAFYBB2019ZX001)资助。DOI:10.1016/j.indcrop.2023.116440
