文献解读：New Phytologist | MicroRNA172通过APETALA2调控拟南芥花序分生组织的大小
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科学
2023-01-11 10:18
北京
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导语：维管植物的叶和花等地上器官的形成取决于茎顶端分生组织(shoot apical meristems,SAM)的活动。SAM大小与花或种子产量呈正相关。SAM的形态和功能会在营养发育向生殖发育的过程中发生变化。
APETALA2-LIKE(AP2-Like)转录因子家族的部分成员是拟南芥花期的关键调控因子。AP2- like基因失活/过表达分别会导致早花/晚花。这些基因的mRNA均被microRNA172调控。而miR172过表达或耗尽也分别致使植物早花或晚花。AP2 在转录后水平亦受到miR172的调控，但这对维持SAM的作用尚不清楚。
1. 对mir172敏感和抗性的AP2在茎尖的表达模式
作者为了解AP2 如何响应miR172活性，从AP2 的内源性调控序列中产生了2个表达AP2 和荧光蛋白VENUS融合的转基因。为了将miR172的活性与AP2分离，在AP2 的编码区引入了同义突变，产生了一个抗miR172的AP2版本。
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通过共聚焦显微镜分析了AP2-VENUS和rAP2-VENUS系幼苗AP2的mRNA水平和SAM中VENUS的表达。在花发育之前(12 LDs)，SAM中AP2-VENUS和rAP2-VENUS蛋白以相似的空间模式积累。然而，AP2-VENUS信号随着植株年龄的增加而降低，并且15 LDs后无法在茎分生组织中被检测到。相比之下，miR172在SAM中与AP2呈反相关。与AP2-VENUS相比，rAP2-VENUS荧光信号在SAM中持续的时间更长。
有趣的是，miR172的积累在rAP2-VENUS植物中被延迟，这可能是rAP2-VENUS植物迟花表型的间接影响。然而，rAP2-VENUS植株在21 LDs时，rAP2-VENUS信号确实与miR172积累重叠，这支持了该转基因对miR172活性具有抗性的可能性。沿着类似时间的过程检测了SAM中的AP2 mRNA，当AP2-VENUS蛋白无法检测到的21 LDs时，仍然在AP2-VENUS植物的分生组织中检测到AP2转录本，这支持了AP2在SAM里转录后调控的重要性。然而，在18~21 LDs的SAM中rAP2-VENUS的表达模式确实变得更加受限，这表明其他调控因子独立于MIR172控制AP2 的丰度。
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2. AP2-VENUS和rAP2-VENUS转基因植物的开花时间和花发育分析
在LDs和SDs条件下，ap2-12突变体都比Col-0开花早，叶片少，而AP2-VENUS植株开花稍晚，叶片多。相比之下，两个rAP2-VENUS株系在LD和SD条件下都表现为明显延迟开花，在SD下延迟更为明显。证实AP2在SD条件下抑制成花转变中起着重要作用，并表明miR172抑制AP2活性是开花所必要的。将AP2-VENUS和rAP2-VENUS转基因导入到ap2-12突变背景中，AP2-VENUS恢复了ap2-12突变体的早花，证实了融合蛋白的功能。然而，rAP2-VENUS ap2-12植物产生的莲座叶明显多于rAP2-VENUS植物，这可能是由于AP2在其自身位点的负反馈调节受损。此外，AP2-VENUS转基因恢复了ap2-12突变体的异常花形态，而rAP2-VENUS植株在花形成方面显示出缺陷。
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3. 花的起始率以依赖于AP2的方式改变
与Col-0对照植株相比，rAP2-VENUS植株的花序紧凑，花朵更多，在整个生命周期中从主枝发育出大量的花，而ap2-12植株从主枝发育的花较少。rAP2-VENUS植株产花量的增加似乎不能用不育花产量的增加来解释，因为ap2-12植株比rAP2-VENUS植株的主枝会产生更多的不育花。作者为了区分AP2在花产生速率和开花结束时分生组织停滞中的作用，统计了即第一朵花开放后每2天的花的数量，结果表明AP2活性的增加导致开花初期的产花速率增加，并延长了花生产的持续时间。为独立评估miR172对提高花朵产量的贡献，统计了mir172abd植株产生的花朵数量。mir172abd突变体在开花早期的开花速度与rAP2-VENUS植物相似，但总体上比rAP2-VENUS植物的开花少。两个rAP2-VENUS转基因株系表现出相同的花数表型，表明mir172abd和rAP2-VENUS在花数量上的差异不是单个rAP2-VENUS转基因插入所特有的。为评估mir172c和mir172e是否解释rAP2-VENUS和mir172abd之间观察到的花产量差异，还计算了mir172abcde植物产生的花数。其花数略高于mir172abd植株，但低于rAP2-VENUS，这表明其他miR172靶标可能影响在mir172植株上观察到的花数的增加。作者还计算了mir172abd ap2-12植株的花数。该基因型的开花量明显少于mir172abd，但略多于Col-0。这表明，开花产量的增加在很大程度上取决于AP2，开花后期其他miR172靶标的贡献可能较小。mir172abd ap2-12和ap2-12在第一朵花开放后到23d之间的成花率是相似的，这表明在分生组织停滞之前miR172的花生产中的作用完全依赖于AP2。 作者测定并比较了Col-0、rAP2-VENUS、mir172abd、ap2-12和mir172abd ap2-12 植株的花序分生组织大小。发现这些基因型间分生组织大小的差异，可能解释了花产量差异，并表明AP2是扩大的分生组织表型所必需的，并且花序分生组织的大小与开花时间无关，而分生组织面积和成花率之间存在着很强的相关性。
为了确定导致这些基因型之间分生组织大小差异的细胞机制，分析了花序分生组织L1中的细胞数量和细胞面积。在ap2-12分生组织的整个分生区，细胞大小的显著增加弥补了细胞数量的减少。在mir172abd ap2-12 植株的分生组织中也观察到了相同的表型，表明AP2是miR172下游分生组织形态的关键调控因子。除细胞数量增加外，rAP2-VENUS 植物分生组织的细胞面积显著增加，但仅在靠近分生组织中央部分的区域，而不在靠近分生组织边界的区域。同样，在mir172abd 分生组织中，同一区域的细胞比Col-0大，但分生组织中的细胞数量与Col-0分生组织中的细胞数量相似。虽然在所测试的大多数基因型中观察到分生组织面积的显著差异，但仅在rAP2-VENUS植株中观察到连续原基之间的角度明显较小。这表明，SAM的大小需要有很大的差异才能影响叶系发散角。综上所述，这些结果表明，在rAP2-VENUS 植物中，花的转变后SAM中AP2表达的持续时间延长与更大的分生组织有关，这是由于细胞数量和面积的增加。
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5. AP2和ARF3 协同控制花序分生组织大小和花芽萌发率
本研究通过比较arf3-2 等几种基因型拟南芥1cm抽薹期的SAM大小，发现arf3-2 的分生组织比Col-0大。分生组织面积的增加是由于细胞面积的显著增加，特别是在PZ的外部。作者通过测量比较基因型间的分生组织面积来确定AP2对分生组织大小的调节是否依赖于ARF3。结果表明ARF3转录的减少可能参与了AP2调节分生组织大小的作用。而不同基因型细胞面积增加在分生组织的不同区域表明，AP2和ARF3通过不同的机制调节SAM的细胞面积，但细胞数量的调节与AP2被ARF3负调控是一致的。通过对1cm抽薹期的茎尖中AP2和ARF3进行定量分析说明，ARF3和AP2在花分生组织中的调控方式可能与在花序分生组织中不同。通过对SAM中VENUS信号的量化分析，ARF3 可能微调AP2 的表达水平，从而有助于调节分生组织的大小。此外，作者通过统计几种基因型间花的数量和出芽率发现arf3-2 在花的早期阶段调节花的生产。结合观察到的分生组织大小，作者推测ARF3 部分通过不同的途径调节分生组织的大小和花的产生。
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6. rAP2在中央区的表达强烈影响花序分生组织的大小
为确定rAP2在分生组织的哪些区域影响芽分生组织大小，作者将rAP2-VENUS与不同的启动子融合，分析rAP2在SAM不同区域的表达情况。结果表明，AP2 在CZ(central
zone)和OC(organizing center)中的特异性表达有助于决定其在决定分生组织的大小中的作用，但花序分生组织大小的增加似乎不是由这些结构域大小不成比例的增加引起的。
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总体而言，miR172及其靶基因在单子叶植物和真双子叶植物之间相对保守的成花转变、发育和维持SAM中发挥着重要作用。本研究表明，AP2 活性的修饰代表了一种增加分生组织大小、花量和种子产量的可行方法，并且更好地理解这种控制背后的机制可能有助于提高农作物生产力。
2022年3月23日，德国马克斯-普朗克植物育种研究所的George Coupland课题组将该研究结果以"MicroRNA172 controls
inflorescence meristem size through regulation of APETALA2 in Arabidopsis"为题发表在New Phytologist上。https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.18111
