MYB（Myeloblastosis）是转录因子超家族，其中，R2R3-MYB是植物所特有且最丰富的一类，参与调控植物生长发育，响应各种非生物胁迫。多个R2R3-MYB在被子植物物种多种细胞类型被广泛报道参与细胞壁木栓质的生物合成以响应渗透胁迫，但对裸子植物MYB的相关研究鲜有报道，是值得探索的研究领域。本课题组研究欧洲云杉（Picea abies）胚性组织超低温保存预处理（Cryoprotectant pretreatment，CPT）早期渗透胁迫响应时，发现PaMYB11显著影响细胞在CPT过程的存活（Hu et al, 2023. Industrial Crops & Products），意味着PaMYB11可能在针叶树的渗透胁迫响应中发挥重要的调控作用。而PaMYB11在裸子植物中作用机制是否与被子植物趋于相似，也是通过促使细胞壁木栓质沉积以响应渗透胁迫？若是，PaMYB11又是调控哪些下游靶基因以及通过哪类木栓质单体/前体物质影响木栓质沉积，亦有待进一步验证。本研究首先对PaMYB11进行系统发育分析，再对PaMYB11转基因系进行RNA-seq、组织化学分析和透射电镜观测，证实PaMYB11可促进欧洲云杉胚性组织细胞壁木栓质沉积，最后结合DAP-seq、Y1H和LUC筛选和验证PaMYB11的3个下游靶基因（PaPOP、PaTET8L和PaADH1）。本研究初步证实PaMYB11通过直接诱导极长链脂肪酸相关基因（PaPOP、PaTET8L和PaADH1）的表达调控木栓质单体的合成，进而促进木栓质沉积，以提高欧洲云杉胚性组织耐渗透胁迫能力，有利于细胞在CPT过程存活。本研究从分子水平上解析了超低温保存机理，也为裸子植物渗透胁迫研究提供新的思路。
主要结果1：PaMYB11属于Subgroup 11 R2R3-MYB
PaMYB11（MA_24271g0020）与126个拟南芥R2R3-MYB进行系统发育分析，发现PaMYB11与拟南芥亚群（Subgroup，Sg）10、11和24的AtMYB聚类在一起。为得到更多关于PaMYB11系统进化信息，将PaMYB11编码蛋白与多个物种Sg 10、11和24 MYB蛋白序列进行比对，构建新的进化树，发现PaMYB11除含有R2和R3 DNA结合结构域外，还包含P-R-X-D-L-L-X结构域（Sg 11特征保守域）（图1），确认PaMYB11属于Sg 11 R2R3-MYB。
图1 多物种PaMYB11的分子系统发育分析
主要结果2：PaMYB11是欧洲云杉胚性组织超低温保存成功的关键
为研究PaMYB11在欧洲云杉胚性组织超低温保存预处理过程（CPT）中作用，以欧洲云杉Pa VIII野生型（U-control）为材料，创制了2个PaMYB11-RNAi系、7个PaMYB11-OE系、8个PaMYB11-SRDX系和1个GUS转化对照细胞系（T-control）。对PaMYB11转基因系进行超低温保存试验发现，PaMYB11-RNAi和PaMYB11-SRDX系几乎无法恢复生长，复性生长量仅为0.01~0.8，显著低于U-control，而U-control、T-control、PaMYB11-OE系复性生长良好，复性生长量为2.4~3.2（图2），表明CPT诱导的渗透胁迫下，PaMYB11的激活是欧洲云杉胚性组织存活所必需的。
图2 欧洲云杉PaMYB11转基因系超低温保存复性生长
主要结果3：PaMYB11诱导欧洲云杉胚性组织细胞壁长链脂肪酸积累
为研究PaMYB11的作用机制，对PaMYB11转基因系进行RNA-seq，GO、KEGG富集分析显示，PaMYB11在脂类代谢调控中具有重要作用（图3）。进而，对PaMYB11转基因系CPT前后样品细胞壁进行脂肪酸含量检测发现，U-control经CPT后，碳链长为20~24的极长链脂肪酸（VLCFA）含量显著增加，碳链长度为C11~C17的中长链脂肪酸（MCFA和LCFA）含量显著降低；PaMYB11-OE系CPT前后VLCFA含量均较高，MCFA和LCFA一直处于较低水平；PaMYB11-SRDX系CPT前后VLCFA含量均较低，CPT后，MCFA和LCFA含量有所下降（图3），说明PaMYB11参与欧洲云杉胚性组织的VLCFA累积。
图3 欧洲云杉PaMYB11转基因系RNA-seq分析与其细胞壁的GC-MS分析
主要结果4：PaMYB11诱导欧洲云杉胚性组织木栓质层的沉积
为研究欧洲云杉胚性组织的耐渗透抗性是否与木栓质层形成有关，于CPT前后分别采集对照（U-control和T-control）、PaMYB11-OE、PaMYB11-SRDX、PaMYB11-RNAi系样品进行透射电镜观测。结果显示，CPT前，对照和PaMYB11-SRDX系未观测到明显的木栓质层，而2个PaMYB11-OE系细胞壁上沉积了明暗交替的木栓质片层结构；CPT后，对照系也出现了明显的木栓质层，且2个PaMYB11-OE系仍然维持木栓质层的沉积，PaMYB11-SRDX系仍未形成木栓质层类似的层状结构（图4）。说明CPT促进了木栓质的积累，且PaMYB11的激活对木栓质层的形成是必要的。
图4 欧洲云杉PaMYB11转基因系透射电镜观测
主要结果5：PaMYB11调控木栓质单体合成的网络
为揭示PaMYB11调控哪些基因影响木栓质的沉积，重点关注PaMYB11-SRDX vs. PaMYB11-OE下调的差异表达基因（DEG）。其中，15个DEG满足既在PaMYB11-OE系显著上调，又在PaMYB11-SRDX系显著下调。进一步相关分析显示，该15个DEG的转录丰度与大部分VLCFA（C20~C24，尤其C22:2和C23:0）的含量呈正相关（图5）。暗示PaMYB11可能通过调控上述15个DEG，促进VLCFA的合成，从而诱导木栓质的沉积。
图5 PaMYB11-OE系上调DEG的脂肪酸含量与转录丰度的相关性分析
主要结果6：PaMYB11与3个靶基因启动子直接互作结合
PaMYB11转基因系RNA-seq筛选得到15个DEG，仅有5个可从欧洲云杉基因组数据库中提取启动子序列（TTS前的1490~2000 bp)。DAP-seq结果显示，在PaPOP、PaTET8L和PaADH1的启动子区域鉴定出至少一个PaMYB11结合motif（图6）。进一步，酵母单杂、双荧光素酶报告基因实验证实PaMYB11可直接与PaPOP、PaTET8L、PaADH1启动子结合，并激活其表达（图6）。
图6 PaMYB11下游靶基因筛选与验证
综上，本研究初步提出PaMYB11作用机制：PaMYB11通过直接激活木栓质单体合成相关基因（PaPOP、PaTET8L和PaADH1）的表达，促进VLCFA的合成，有利于欧洲云杉胚性组织细胞壁木栓质沉积，以提高其耐渗透胁迫的能力（图7）。
图7 PaMYB11的作用模式
研究结果以题为“PaMYB11 promotes suberin deposition in Norway spruce embryogenic tissue during cryopreservation: A novel resistance mechanism against osmosis”在线发表于The Plant Journal，中国林业科学研究院林业所博士后胡继文为该论文第一作者，林业所王军辉研究员和林木遗传育种全国重点实验室朱天擎助理研究员共同为该论文通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划（2023YFD2200603）、中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（CAFYBB2019ZX001）和国家资助博士后研究人员计划（GZC20233017）资助。
