A PtrLBD39-mediated transcriptional network regulates tension wood formation in Populus trichocarpa
基本信息：该文章是东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室李伟研究团队的科研成果，发表在Plant Communications 期刊上。东北林业大学在读博士研究生于晶为该论文第一作者，李伟教授为该论文的通讯作者，姜立泉教授参与指导该项工作。该研究得到国家重点研发计划和国家自然科学基金等项目资助。
主要结果：
1. 鉴定毛果杨应拉木形成中相关的转录因子
本研究以4月年龄的温室栽培的毛果杨为材料，通过90度弯曲植株0、3、5、7、14和21天后，诱导其茎部产生TW。采用激光捕获显微解剖技术 (LCM) 收集6个弯曲时间点的TW形成中的细胞，进行全转录组RNA-seq分析。不同弯曲时期与直立对照相比，共鉴定出1506个差异表达的转录因子，分别来自56个不同的家族。其中PtrLBD39 (Potri.005G097800) 在4个时间点 (5、7、14和21天)，上调了20.9 ~ 42.5倍。其旁系同源基因PtrLBD22对弯曲应力的响应也出现上调，但幅度远小于PtrLBD39。这两个基因与TW的发育密切相关，可能在控制TW的形成中有冗余功能。
2. 基于PtrLBD39 及其同源基因PtrLBD22 的CRISPR基因编辑减少了毛果杨TW的形成
利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统，获得了PtrLBD39 单敲除突变体和PtrLBD39 和PtrLBD22 双敲除突变体。为探究PtrLBD39 和PtrLBD22 在TW形成过程中的作用，将单、双突变体和野生型毛果杨经过7天的弯曲。结果发现，突变体ptrlbd39 的TW宽度、G纤维层数略有下降，导管直径略有增加，ptrlbd39/22 双突变体则变化程度更大；此外ptrlbd39 中TW/OW比野生型植株减少了约8%，在ptrlbd39/22 中减少了约15%，表明双突变体的TW分化减少。在PtrLBD39 和PtrLBD22 敲除对重力刺激影响茎生长发育的研究中，受90°重力刺激17天后，ptrlbd39/22 双突变体的TW宽度和不对称生长较野生型有所降低。综上结果表明，ptrlbd39/22 双突变体能够抑制TW形成和减少不对称增长，从而降低茎恢复直立位置的能力。
3. 毛果杨PtrLBD39 和PtrLBD22 的突变导致TW中木质素含量增加，纤维素含量降低
TW具有木质素含量低、纤维素含量高等特点。研究者推测PtrLBD39 和PtrLBD22 是形成TW所必需的，其功能缺失会使TW中木质素含量升高，纤维素含量降低。为了验证假设，研究者分析了ptrlbd39/22 双突变体在21天弯曲后的木材组成，发现ptrlbd39/22 突变体的TW木质素含量比野生型平均高出约18%，双突变体的纤维素含量（以葡萄糖含量表示）减少了约6%。
4. PtrLBD39 和PtrLBD22 调控一组TW相关基因
对ptrlbd39/22 双突变株和野生型植株经过7天的弯曲后，采集TW组织进行了RNA-seq测序。为了鉴定PtrLBD39 调控的基因，对毛果杨进行7天拉弯处理后基于LCM的RNA-seq差异基因(DEGs),和ptrlbd39/22 突变体的RNA-seq的DEGs进行分析。结果发现，进行拉弯处理的ptrlbd39/22 突变体与野生型相比、或野生型株系进行重力刺激或机械胁迫后，包括一些MYB基因、PtrHSFB3-1、ARK2 等已被报道参与杨树TW的形成或木质素的生物合成的基因呈现显著差异表达。
5.PtrLBD39 和PtrLBD22 改变了关键细胞壁组成基因的表达模式
RNA-seq分析显示，在ptrlbd39/22 突变体中，能调控木质素生物合成的PtrC4H2、PtrCCR2、PtrPAL1 和PtrPAL3 基因表达上调，这与双突变体TW中木质素含量的增加相一致。ptrlbd39/22 突变体TW中所有次生细胞壁纤维素合酶基因均受到抑制，这与其纤维素含量降低一致。ptrlbd39/22中TW的细胞壁组成与NW相似，暗示 PtrLBD39 和PtrLBD22 的缺失降低了弯曲应力下TW发育的程度。
转录组分析中发现，有一个与干旱胁迫相关的转录因子PtrNAC006 在ptrlbd39/22 中受到重力刺激或机械应激后上调，提示植物对重力刺激、机械胁迫和干旱胁迫的响应可能是协同调控的。研究者通过PtrNAC006 (OE-PtrNAC006)的过量表达发现，PtrNAC006 除了促进了抗旱能力外，还显著减少了TW的形成，表现为TW宽度减小，TW的 G-fiber层减少，导管增加，OW侧宽度小于TW侧。木材成分分析表明，与野生型相比，OE-PtrNAC006的茎TW在经过21天的弯曲后，纤维素含量降低了约27%，木质素含量增加了约30%。结果表明，耐旱性强的调节基因PtrNAC006 也是TW形成的重要负调控因子。
7.PtrLBD39 直接靶基因的全基因组鉴定
为了研究哪些基因直接受PtrLBD39调控，研究者通过ChIP-seq分析检测了PtrLBD39的全基因组结合位点。在1122个推测的靶基因上共鉴定出1,203个PtrLBD39结合位点，PtrLBD39结合位点主要富集在启动子区域，有512个PtrLBD39直接靶基因包含一个或多个PtrLBD39结合位点。利用DREME分析发现"CGGC"核心序列富集在PtrLBD39结合位点，这与之前的发现一致，即LBD蛋白优先与该核心序列结合，支持ChIP-seq分析的可靠性。
8. PtrLBD39介导TW相关的转录调控网络
首先分析了基于LCM的RNA-seq挖掘的DEGs和ptrlbd39/22 双突变体RNA-seq的DEGs，共鉴定了6200个基因，这两个DEG群体的共同基因表示对TW胁迫反应最强烈的基因。将PtrLBD39的512个直接靶点与6200个TW反应基因进行重叠，发现了198个核心基因，这些基因可能在TW形成过程中直接受到PtrLBD39的调控。针对198个核心基因中的26个TFs，构建了一个PtrLBD39介导的转录调控网络 (TRN)，PtrLBD39直接激活5个TF基因表达，抑制21个TF基因。其中包括了两个TW形成的负调控因子PtrNAC006和PtrHSFB3-1，以及10个细胞壁组成基因。综上，研究发现了一个PtrLBD39介导的TRN，对TW的特征形成(不对称生长、纤维增加、低木质素和高纤维素) 至关重要。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.xplc.2021.100250
