能工巧匠，必善用其器。Lonza旗下的电穿孔核转染技术 (NucleofectionTM) 无疑是细胞转染的超强利器。电穿孔核转染是一种升级版的转染技术，它克服传统电穿孔方法在转染效率和细胞活力方面的限制。NucleofectorTM通过优化电场和脉冲条件，提高了难以转染细胞的转染效率，并在基因功能研究、蛋白质表达以及基因编辑和细胞治疗等多种应用和各个领域中展现出良好的前景。
2020年，哈萨克斯坦努尔苏丹纳扎尔巴耶夫大学阿斯塔纳国家实验室生命科学中心的Sholpan Askarova团队在Regenerative Medicine上发表了题为 “Mesenchymal stem cells modifications for enhanced bone targeting and bone regeneration” 的综述性文章，系统了阐述了包括电转染 (Electroporation)在内的细胞编辑技术，对 “改造” 间充质干细胞，提高其促进骨骼修复的能力，让骨骼再生成为可能【1】。造血干细胞 (Hematopoietic Progenitor Cells: HPC) 是多种疾病治疗过程中自体和异体的细胞移植的供体，遗传标记HPC并进行后续的命运追踪是干细胞领域一项重要的研究方法。2006年，德国乌尔姆医学部Jan Torzewski团队在Future Medicine 上发表了题为 “Efficient transient genetic labeling of human CD34+ progenitor cells for in vivo application”的研究性文章【2】。该研究通过细胞核转染(nucleofection) 技术在不同谱系的造血干细胞中转染了截短的低亲和力神经生长因子受体 (ΔLNGFR) ，筛选出Mutz2细胞可能作为人类髓系HPC的体外模型。该研究所描述的方法在NucleofectorTM的助力下，已适应于良好生产规范（GMP）标准，并已准备好用于体内应用。在此过程中，NucleofectorTM重要作用不可忽视，它不仅提高了遗传标记的效率，还确保了细胞的正常分化能力，为后续的研究和应用提供了可靠的基础。3.肿瘤治疗新思路，CRISPR编辑DNA甲基化修饰2020年，伊朗加兹温医科大学联合医学院医学检验科学系的Mehdi Azad团队在Future Medicine上发表了题为 “CRISPR-mediated modification of DNA methylation pattern in the new era of cancer Therapy” 的综述性文章【3】。该文章总结了DNA甲基化对肿瘤发生发展的影响，同时汇总了如何运用不同的CRISPR-Cas9系统来进行基因编辑，表观修饰和染色体结构的调控。那么，NucleofectorTM结合不同的CRISPR转染体系无疑是实现相关基因编辑，表观修饰编辑，和染色体结构调控的强大工具，是实现肿瘤基因治疗的重要手段。4.电转CRISPR与Flow Cytometry有效结合，解锁免疫细胞疗法与其他基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9 是最为广泛应用的手段。Flow Cytometry则是长维度筛选鉴定基因编辑后免疫细胞，包括淋巴细胞，表面标记物、性质、功能的重要方法。2022年，美国国家标准与技术研究院生物系统和生物材料部Lili Ma团队在BioTechniQue上发表了题为“Evaluation protocol for CRISPR/Cas9-mediated CD19 knockout GM24385 cells by flow cytometry and Sanger sequencing”，的研究方法型论文【4】。该研究详细的描述了如何利用4D-NucleofectorTM (AAF-1003B; Lonza, NJ, USA) 和 SF Cell Line Kit (V4XC-2032 or V4XC-2012; Lonza) 成功转染CRISPR/Cas9-gRNA到类成淋巴细胞系GM24385中；接着通过Flow Cytometry鉴定CD19 敲除后GM24385的细胞特性，为安全，高效的细胞基因编辑和免疫疗法提供坚实的基础。不断升级，不断优化的NucleofectorTM转染体系近期，Lonza团队成功优化了人源肝脏原代细胞 (Primary Human Hepatocyte: PHH) 的培养和转染条件，实现了高效、低毒性的PHH转染，转染后的PHH能良好的维持细胞特性、功能。人源肝原代细胞维持部分肝细胞功能，用于模拟肝脏响应药物处理和药毒性检测的重要细胞模型，但PHH难转染，细胞敏感易退化的特性严重限制了其在科研和药物筛选领域的应用。而Lonza团队优化了的培养和优化条件则突破了这些障碍，再高效转染后的第7天，PHH仍然维持着良好的细胞特性。这些无疑为更好的在科研和药物筛选过程中使用PHH提供了强大的技术支撑。![]()
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Efficient Transfection and Sustained Long Term Functionality of Primary Human Hepatocytes
此外，Lonza团队用全新升级的4D-NucleofectorTM系统成功构建了可诱导型的Cas9 T细胞，为基础研究提供了强大的筛选平台，更为CAR-T细胞疗法提供的坚实的基础。实验数据直观显示，无论是敲除 (Knock-out) 还是过表达 (Knock-in)，有了NucleofectorTM转染技术的加持，都实现了高效、稳定的基因编辑。
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Inducible Cas9 T Cells: An Innovative Platform for Allogenic CAR-T Cell Generation
专家视角：
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斯坦福大学生理学医师，Arsenal Biosciences 的联合创始人Theodore Roth (MD, Ph. D)，是电穿孔核转染领域的资深专家。Theo在加州大学旧金山分校修MD-Ph. D学位时，便成功借助了电穿孔核转染技术结合混合敲入技术，在人原代免疫细胞中进行大规模的基因编辑。Theo指出他们利用了96-well NucleofectorTM转染系统，进行了混合基因编辑和单个基因中高通量的编辑的多个实验，回答了其课题中所提出的多个科学问题。正是这种电核转染中高通量技术的出现和使用，让药物靶点筛选更为便捷，更为高效。今年9月， Lonza的电穿孔核转染技术更是助力Arsenal Bioscience实现了实体瘤CAR-T细胞疗法的完美设计，助力其赢得了今年细胞疗法领域全球最大的私募融资。Arsenal Biosciences的核心技术是非病毒载体的基因编辑CITE技术 (CRISPR Integration of Transgenes by Electroporation)，即利用 Lonza的电穿孔核转染手段实现T细胞的转基因CRISPR整合技术，使T细胞有选择的靶向肿瘤，从而使得患者的免疫系统在不破坏正常组织的情况下摧毁肿瘤细胞。
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Arsenal Bioscience CITE programming via Nucleofector
无论是领域内的专家视角，还是NucleofectorTM在各种细胞类型、各种递送物质、各种科研方向的实际应用，以及对CAR-T细胞基因编辑等临床治疗方面的技术支撑都切实的呈现了Lonza NucleofectorTM平台的强大实力和对科研领域、药物筛选、细胞疗法的超强助力。与此同时，Lonza的专家团队和全体工作人员，不断探索、优化、升级，更是为广大科研工作者和药物开发者提供了越来越完善、完备的方案和体系，让大家真正的实现了转染的高效无忧。关注Lonza Bioscience微信，扫码即可获得文中资讯完整版、及更多NucleofectorTM实验方案：![]()
参考文献：
1.Safarova Y, Umbayev B, Hortelano G, Askarova S. Mesenchymal stem cells modifications for enhanced bone targeting and bone regeneration. Regen Med. 2020 Apr;15(4):1579-1594. doi: 10.2217/rme-2019-0081. Epub 2020 Apr 16. PMID: 32297546.
2.Wiehe JM, Niesler C, Torzewski J, Zimmermann O, Wiesneth M, Schmitt M, Schwarz K, Döhner H, Hombach V, Greiner J. Efficient transient genetic labeling of human CD34+ progenitor cells for in vivo application. Regen Med. 2006 Mar;1(2):223-34. doi: 10.2217/17460751.1.2.223. PMID: 17465806.
3.Maroufi F, Maali A, Abdollahpour-Alitappeh M, Ahmadi MH, Azad M. CRISPR-mediated modification of DNA methylation pattern in the new era of cancer therapy. Epigenomics. 2020 Oct;12(20):1845-1859. doi: 10.2217/epi-2020-0110. Epub 2020 Nov 13. PMID: 33185489.
4.Inwood SL, Tian L, Parratt K, Maragh S, Wang L. Evaluation protocol for CRISPR/Cas9-mediated CD19 knockout GM24385 cells by flow cytometry and Sanger sequencing. Biotechniques. 2022 Jun;72(6):279-286. doi: 10.2144/btn-2022-0015. PMID: 35703314.
