合成生物学作为具有战略意义的新兴生命科学方向，旨在设计和构建具有新功能或改进功能的生物系统。定向进化作为合成生物学核心赋能技术，广泛应用于生物大分子药物优化、新型酶制剂开发、代谢途径拓展与优化，以及高灵敏度、高选择性生物传感器的研发等领域【1】。传统定向进化需先在试管中构建突变文库，再转入微生物细胞进行表达和筛选，过程耗时且繁琐，限制了对生物大分子适应度空间的探索广度和深度。连续定向进化将基因复制，突变文库构建、表达和筛选等步骤在细胞（或病毒）内进行无缝衔接，可以实现自动化的多轮迭代进化，极大地提高了突变文库构建和表型筛选的效率。基于微生物的连续定向进化已经在多个应用场景下表现出优于传统定向进化的性能【2-4】。长期以来，由于微生物版本的连续定向进化方法较为成熟，而哺乳动物细胞生长缓慢、培养成本高且工程改造困难，即使医用蛋白药物的进化，仍常在微生物中进行。这严重限制了可进化目标的范围与功能，因此，需要发展基于哺乳动物细胞的连续定向进化方法。尽管CRISPR-X/TAM，TRACE，VEGAS和HACE等技术在这一领域取得了初步进展，但是目前哺乳动物细胞中还缺乏一个具有优越的突变性能（包括可控的高突变率，宽突变谱和长的突变范围），不影响宿主细胞状态（包括不影响宿主基因组和宿主生理状态），且可以同时兼容多种选择或筛选操作的连续定向进化方法【5-6】。2025年1月3日，北京大学定量生物学中心林一瀚实验室在Nature Chemical Biology杂志发表题为Orthogonal RNA replication enables directed evolution and Darwinian adaptation in mammalian cells的研究论文，报道了一种基于正交甲病毒RNA复制系统的哺乳动物细胞连续定向进化新方法。 从定向进化的发展历程来看，基于RNA的定向进化实验早于基于DNA的实验。然而，由于RNA不稳定且其复制系统难以控制，大多数研究仅限于生命演化的基础理论，少数基于RNA病毒的定向进化系统也暴露出如宿主细胞病变和生物危害等明显缺陷。尽管如此，RNA复制系统在突变引入方面天然具有优势。因此，若能规避病毒系统的缺陷，基于RNA正交复制系统可能发展出一种具有优越性能的新型哺乳动物细胞中的连续定向进化平台。基于以上逻辑，研究者首先通过理性设计和文库筛选相结合的思路，将Sindbis RNA复制子（一种删除结构蛋白的甲病毒RNA基因组）上的复制酶nsP4迁移到宿主基因组表达，使得甲病毒RNA以复制酶限制模式复制，同时通过饱和突变文库筛选优化非结构蛋白nsP1，nsP2和nsP3的连接子序列。这一策略大大削弱宿主细胞病变，将在哺乳动物宿主细胞中构建稳定维持的正交RNA复制系统的效率提高了约1000倍（图1）。进一步的，通过对常用的核糖核苷类似物进行筛选，研究者发现新冠肺炎的治疗药物Molnupiravir可以高效、浓度依赖地诱导甲病毒RNA复制子的碱基转换突变，最高可达约1bp/kb/day，且不影响宿主基因组和宿主细胞状态。图1：利用甲病毒RNA复制机制改造出可在哺乳动物细胞中长期稳定维持的正交RNA复制系统。
结合这两点，研究者构建了一个RNA复制酶辅助的哺乳动物细胞的连续定向进化平台REPLACE（RNA replicase-assisted continuous in vivo evolution）（图2）。该方法利用了正交、稳定的RNA复制系统及可诱导碱基突变的诱变分子。其中，Sindbis RNA复制系统与宿主细胞基因组相互独立，互不影响，可支持连续的、长期的RNA进化实验，且每个细胞含有约102个病毒RNA分子，理论上可在一周内构建超过1010规模的突变体文库，有效克服了低效率的转染以及哺乳动物细胞增殖缓慢而难以在哺乳动物细胞内形成大规模突变文库的困难。REPLACE所使用的核糖核苷类似物能有效地在细胞内诱导装载有进化目标基因的病毒RNA高频突变。整体而言，REPLACE实现了外源RNA分子在哺乳动物细胞中的长期复制及小分子可控的RNA诱变，并支持以连续或非连续模式进行定向进化实验。 图2：基于正交RNA复制系统和核糖核苷类似物诱导的RNA突变，开发出了一种可在哺乳动物细胞中对生物大分子进行连续定向进化的方法——REPLACE。
利用该方法，研究者首先以荧光蛋白作为例子，发现该系统可高效进化出使得绿色荧光蛋白蓝移的多个突变和突变组合。接下来，研究者以合成转录因子PadR作为进化对象，发现了一系列可以提高转录因子动态激活范围甚至逆转转录因子对化学小分子响应模式的突变组合。进一步的，研究者利用该系统探究了MAPK信号通路关键蛋白MEK1克服抑制剂作用的逃逸机制和KRAS的显性负向突变KRAS（S17N）的逃逸机制，鉴定到多个新的功能突变以及最多可达4个突变的组合。这些结果有力表明了REPLACE在不同应用场景下的适用性，以及其有效探索复杂序列—适应度景观的能力。REPLACE是领域内首个基于正交RNA复制系统的连续定向进化方法，为定向进化技术开辟了新方向。这一全新的RNA进化平台有望显著提升医学合成生物学的应用潜力，赋能哺乳动物细胞内生物大分子的连续定向进化，并推动哺乳动物细胞及组织的适应性工程改造，为基础研究、医学诊断和治疗提供重要支持。REPLACE相关质粒可通过WeKwikGene平台获取。 本研究由北京大学林一瀚实验室完成，博士后马良为第一作者。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41589-024-01783-2
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1. Lienert, F., Lohmueller, J.J., Garg, A., and Silver, P.A. (2014). Synthetic biology in mammalian cells: next generation research tools and therapeutics. Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 95–107. https://doi.org/10.1038/nrm3738.2. Morrison, M.S., Podracky, C.J., and Liu, D.R. (2020). The developing toolkit of continuous directed evolution. Nat Chem Biol 16, 610–619. https://doi.org/10.1038/s41589-020-0532-y.3. Molina, R.S., Rix, G., Mengiste, A.A., Álvarez, B., Seo, D., Chen, H., Hurtado, J.E., Zhang, Q., García-García, J.D., Heins, Z.J., et al. (2022). In vivo hypermutation and continuous evolution. Nat Rev Methods Primers 2, 36. https://doi.org/10.1038/s43586-022-00119-5.4. Rix, G., Williams, R.L., Hu, V.J., Spinner, A., Pisera, A. (Olek), Marks, D.S., and Liu, C.C. (2024). Continuous evolution of user-defined genes at 1 million times the genomic mutation rate. Science 386, eadm9073. https://doi.org/10.1126/science.adm9073. 5. Hendel, S.J., and Shoulders, M.D. (2021). Directed evolution in mammalian cells. Nat Methods 18, 346–357. https://doi.org/10.1038/s41592-021-01090-x.6. Chen, X.D., Chen, Z., Wythes, G., Zhang, Y., Orr, B.C., Sun, G., Chao, Y.-K., Navarro Torres, A., Thao, K., Vallurupalli, M., et al. (2024). Helicase-assisted continuous editing for programmable mutagenesis of endogenous genomes. Science 386, eadn5876. https://doi.org/10.1126/science.adn5876.
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