01
巨噬细胞AIF1在MI后升高 促进心脏炎症
1.1 研究模型
人类MI心肌样本、小鼠永久MI模型、辐照骨髓-骨髓移植嵌合鼠模型
1.2 实验方法
单细胞组学分析、免疫荧光染色、TTC染色、流式细胞技术、超声心动图、qPCR
1.3 研究结果
作者首先在公开发表的人类MI单核转录组数据中分离出巨噬细胞群（图1a-b），并发现AIF1只在巨噬细胞中富集，且在MI后表达升高（图1c-d）。按梗死部位分类发现AIF1仅在梗死区巨噬细胞上调，而未梗死区水平与对照组相近（图1d）。对高表达AIF1的巨噬细胞进行通路分析发现胞吞、抗原递呈等免疫过程相关基因富集（图1e）。
图1上. MI患者巨噬细胞AIF1上调
对MI后不同时间节点的人类心肌样本进行免疫荧光染色，发现急性MI后表达AIF1的CD68+巨噬细胞随时间显著升高（图1f）。
图1下. MI患者巨噬细胞AIF1上调
随后利用小鼠MI模型验证了以上发现。MI后梗死区AIF1+CD68+巨噬细胞数量和表达强度随梗死后时间增加（图2a-b），而单核细胞与中性粒细胞AIF1表达无显著改变（图2c-d）。流式细胞学发现招募型巨噬细胞（CCR2+）表达AIF1水平最高（图2e-f）。
图2. 小鼠MI模型中心脏巨噬细胞AIF1上调
为了探究招募型巨噬细胞AIF1在MI后的作用，作者构建了辐照小鼠-Aif1敲除小鼠骨髓移植嵌合模型（图3a），嵌合鼠血细胞均为Aif1-/-（图3b）。
图3上. 骨髓来源巨噬细胞AIF1加重MI后心脏重构
相比于假手术组，嵌合鼠MI后梗死面积显著缩小（图3c），心脏功能和结构指标显著改善（图3d）。
图3下. 骨髓来源巨噬细胞AIF1加重MI后心脏重构
利用流式细胞技术对骨髓Aif1缺陷鼠MI后1周的浸润炎性细胞进行分析，发现心脏、外周血和免疫器官中的单核细胞、中性粒细胞响应强度和数量均无显著差异，提示AIF1仅在梗死心脏中发挥作用（图4a-d）。
图4上. 骨髓来源巨噬细胞AIF1加重MI后炎症巨噬细胞响应
值得注意的是，骨髓Aif1缺陷鼠MI后巨噬细胞丰度也无明显改变（图4a），但活化巨噬细胞（CD80+）显著减少（图4e）。相反，抗炎巨噬细胞（CD206+）增加（图4f），同时巨噬细胞清除心肌细胞碎片的胞葬作用不受影响（图4g）。嵌合鼠MI后促炎介质显著降低，促炎因子升高（图4h）。
图4下. 骨髓来源巨噬细胞AIF1加重MI后炎症巨噬细胞响应
02
AIF1促进巨噬细胞活化的机制研究
2.1 研究模型
Aif1缺陷骨髓来源巨噬细胞（BMDM）
2.2 实验方法
qPCR、Western blot、Seahorse细胞呼吸检测、荧光共聚焦成像、原子力显微镜
2.3 研究结果
作者首先利用坏死心肌细胞提取物（NMC）刺激BMDM，构建了MI后巨噬细胞的细胞模型。因为NMC中包含TLR2和TLR4激活配体，而观察到巨噬细胞的炎性效应主要来源于TLR4激活，因此作者直接采用了更为成熟的TLR4激活物脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞活化。Aif1敲除BMDM激活后TLR4相关炎症基因和蛋白表达降低（图5a-b）。
既往证实TLR4激活HIF-1α，促进巨噬细胞糖酵解，而与对照组相比，Aif1敲除BMDM激活后HIF-1α表达并未升高，同时HIF靶基因产物减少（5c-e）。提示AIF1通过促进TLR4对HIF-1α的激活发挥促巨噬细胞活化作用。
图5上. AIF1促进巨噬细胞HIF-1α依赖的促炎性糖酵解重编程
对活化的BMDM细胞进行细胞呼吸检测，发现与对照组相比，Aif1缺陷细胞在活化后的糖酵解并无显著增加，而给予HIF激活剂氯化钴可以恢复Aif1缺陷BMDM活化后的糖酵解增加（图5f-g）。HIF靶基因产物的变化模式类似（图5h-i）。
图5下. AIF1促进巨噬细胞HIF-1α依赖的促炎性糖酵解重编程
由于AIF1既往被证实与肌动蛋白聚合相关蛋白Rac1互作，而图1e中发现MI患者巨噬细胞肌动蛋白相关过程基因富集，于是作者接下来探讨AIF1与Rac1之间的互作。
敲低Rac1或施加微丝聚合抑制剂CytoD后抑制了BMDM的肌动蛋白重构，与Aif1缺陷造成改变相似（图6a）。使用原子力显微镜对细胞硬度进行检测，发现TLR4激活增加对照组（而非Aif1缺陷）BMDM硬度（图6b）。Aif1缺陷BMDM活化后Rac1-GTP结合减少（图6c）。同时，TLR4刺激使AIF1和Rac1共定位增加，提示二者在巨噬细胞活化时发生互作（图6d-e）。
敲低Rac1对HIF及相关促炎因子的改变与Aif1缺陷相同，提示二者通过同一机制参与该过程（图6f-h）。
图6. AIF1与RAC1互作促进巨噬细胞糖酵解重编程
既往研究证实TLR4刺激后通过NADPH氧化酶（NOX）产生活性氧激活HIF-1α，而Rac1直接参与NOX活化。因此作者接下来探究Rac1是否通过活化NOX充当AIF1和HIF-1α之间的桥梁。
果然，给予NOX抑制剂GSK2795039后，TLR4刺激导致的HIF-1α激活、糖酵解增加和促炎因子上调效果被取消（图7a-d）。Aif1缺陷BMDM活化后ROS产生水平与抑制NOX相近（图7e），同时NOX活化标志p40phox亚基磷酸化减少（图7f）。提示AIF1与NOX激活相关。
图7. AIF1依赖的巨噬细胞促炎性糖酵解重编程伴随NOX激活
03
靶向AIF1反义寡核苷酸治疗改善MI后心脏表型
3.1 研究模型
MI小鼠模型
3.2 实验方法
qPCR、流式细胞技术、TTC染色、超声心动图
3.3 研究结果
最后作者验证了靶向AIF1的治疗潜力，作者生产了靶向Aif1的反义寡核苷酸（Aif1 ASO），成功降低了Aif1表达（图8a-c）。Aif1 ASO显著减少巨噬细胞在梗死区的富集，相反增加了保护性的组织驻留型巨噬细胞（图8d-e）。治疗组心肌炎症因子、心肌梗死面积与超声结构和功能指标均得到显著改善（图8f-h）。
图8. 靶向AIF1的反义寡核苷酸缓解MI后心脏炎症并促进心脏修复
研究总结
本文属于经典的分子生物学机制研究文章，但也首先利用了人类心梗患者的单核转录组数据引出关键分子AIF1，并在小鼠模型验证。随后，作者转向骨髓来源巨噬细胞模型对TLR4-AIF1-Rac1-NOX-HIF-1α作用轴的逻辑关系进行了分子生物学验证，并探究了以上分子对巨噬细胞肌动蛋白和糖酵解代谢的改变。最后利用反义寡核苷酸验证了AIF1作为MI后抑制心室重构治疗靶点的潜力，使文章更加完整。
参考文献：
写在最后
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图文：往观
审核：定观
编辑：往观
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