当今，高通量组学测序技术可谓是高分文章的宠儿，科研工作者的宝器，尤其是在绘制疾病图谱、发现关键靶点、揭示疾病机制、找寻生物标志物以及推动个性化医疗等领域。Bulk RNA-seq就像是基础实验中的Western Blot（WB），是一项必备的核心生物信息学分析技能。现在开始学习，永远不算晚。跟随我们一起，重新启程，深入探索bulk RNA-seq的无限可能！
上期我们介绍了借助bulk RNA-seq寻找具体的靶点和分子通路（小白也能看懂的Bulk RNA-seq思路 | 第2期. 不知道研究哪个分子哪条通路？转录组测序来帮你！）本期我们将为大家介绍bulk RNA-seq在寻找预后相关细胞类型和靶基因中的应用。
01 Nat Commun.丨The integrated molecular and histological analysis defines subtypes of esophageal squamous cell carcinoma. （IF=14.7）
▶ 运用bulk组学的目的：bulk RNA-seq提供差异表达的分子信息，确定ESCC的“分子分型”。结合反卷积提供的细胞信息、组织切片提供的病理信息以及临床预后信息，使用AI深度学习构建“预后-病理-细胞-分子”网络，同时回答肿瘤的“分子亚型”与“病理亚型”是否相匹配这一问题，为ESCC的诊断提供临床价值。
▶ 分析方法：
【非负矩阵分解NMF：确定分子亚型】对120例ESCC患者的肿瘤组织RNA-seq结果进行无监督聚类，可分为四个亚型。对每个亚型的代表性基因进行功能注释，确定了四个亚型分别为“分化性”、“免疫原性”、“代谢性”和“干性”。其中，“干性”亚组特征基因为WFDC2、SFRP1、LGR6和VWA2，其预后最差，是我们重点关注的对象。
【GSEA富集分析：确定分子通路】确定富集到每个亚型的主要通路。对于“干性”亚型，展示了GSEA分析中三个主要下调的通路，即“干扰素γ信号通路”、“T细胞受体（TCR）通路”和“趋化因子信号通路”。 图1. 中国ESCC的转录组学亚型
【反卷积分析：确定关键细胞】将差异表达的基因反卷积到发挥作用的关键细胞，不仅找到了与预后相关的NK细胞，而且发现了目标基因XCL1。详细而言，基于免疫细胞估计的共识聚类揭示了三个免疫细胞谱簇：C1与低水平的免疫细胞浸润相关，但与相对高水平的中性粒细胞、树突状和肥大细胞有关；C2与高水平的B 细胞、T 细胞和巨噬细胞免疫浸润有关；C3与除NK细胞外，低水平的免疫浸润相关，且与NK细胞标志物XCL1、XCL2的高表达显著相关。
【Cox回归分析：确定预后关系】使用多因素Cox回归在矫正患者年龄、饮酒和吸烟史、肿瘤分期和分级的混杂后提示，高NK细胞丰度是ESCC最强的不良预后因素。
【相关性分析：桥接分子亚型与免疫类型】四种ESCC分子亚型和三种免疫谱簇之间的比较表明非随机相关性：C3群的31例病例中有15例（48.4%）是“干性”肿瘤，而“分化”和“免疫原性”亚型分别在 C1 和 C2 集群中过度代表。LGR6 和 XCL1 （r = 0.40， p < 0.0001）、XCL2 （r = 0.39， p < 0.0001） 和 CD160 （r = 0.32， p = 0.0003） 之间 mRNA 表达呈正相关，表明“干性亚组”与NK细胞之间存在关联。
图2. ESCC中免疫细胞浸润的异质性
【来复习！热图+GSEA图+小提琴图】利用CCLE数据库中RNA-seq数据分析XCL1/2与 ESCC的关联。基于XCL1高（n = 11）和低（n = 11）ESCC细胞系之间差异表达基因（n = 413，P < 0.01）进行聚类分析。GSEA结果进一步显示，XCL1高表达细胞表现出药物代谢细胞色素 P450、视黄醇代谢和生物氧化途径的上调；细胞周期基因集富集评分下调。
图3. 高表达XCL1的ESCC细胞的特征
💜 研究思路小结：运用bulk RNA-seq鉴定肿瘤的分子亚型，反卷积确定预后相关细胞和关键基因，再通过Cox回归分析确定和预后的关系，是常见且可复现的研究思路。更高级的研究思路是用scRNA-seq和空间转录组看看关键细胞和疾病的关系，让我们接着浅浅看下它们的运用思路！
02 Nat Commun.丨Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages in colorectal cancer （IF = 14.3）
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图文：仓观
审核：定观
编辑：仓观
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