小麦结构变异解析
的最佳工作流程
结构变异(SVs)具有更高的复杂性——插入、缺失、重复、反转和易位，大小从50 bp到数百兆碱基(Mb)不等，广泛存在于植物基因组中，构成了高度多样化的遗传多样性。由于频繁的基因组复制和转座事件，SVs会影响50%的植物基因组，在植物表型性状中起着关键作用，如重要农艺性状：玉米开花时间(Vgt1、ZmCCT)、水稻产量(GW5和GL7)等。
然而，由于其复杂性和早期基因组技术的限制，大多数SV的NGS检测效果不佳。第三代测序技术的最新进展，特别是新的PacBio循环一致性测序(CCS，又称HiFi测序)在低错误率(< 0.2%)和长读长(> 10 kb)之间取得了完美的平衡，以90%≥Q30的长读长数据大大提高了SV检测的性能。
2024年9月6日，中国科学院遗传与发育生物学研究所鲁非研究组在The Plant Journal在线发表题为“Structural variation discovery in wheat using PacBio high-fidelity sequencing”的研究论文。该论文选取高转座元件含量（约85%）的六倍体面包小麦及其祖先供体为研究对象，对小麦材料进行了利用PacBio HiFi测序，并通过对主流长读长对齐算法和SV调用算法的评估，提供了使用HiFi reads进行SV基因分型的最佳工作流程；并从低深度HiFi（skim HiFi）测序中发现SV的显著准确性，表明skim HiFi测序在群体水平上是有效和优选的策略。该研究将有助于小麦和其他植物中SV的发现和生物学功能的破译。
结果与讨论
小麦SV参考数据集
SV参考数据集对于测试SV分析算法方法至关重要。为了解决小麦缺乏SV参考数据集的问题，研究人员从头开始构建一个稳健的小麦SV参考数据集，这个过程包括三个步骤(图1)。①生成候选SV调用集：基于HiFi测序通过长读长对齐算法和调用算法生成了全面的SV调用集。②构建参考数据集：利用深度NGS对所有候选SV进行验证（缺点：识别大型SV的完整结构方面存在局限性）而形成参考数据集。③验证参考数据集：采用从头组装、PCR扩增和Sanger测序来评估SV参考数据集的完整性。
图1. 参考数据集构建流程。
长读长对齐算法-SV调用算法组合的性能比较
研究人员对面包小麦及其祖先供体野生二粒小麦 (Triticum turgidum ssp. dicoccoides)和节节麦(Aegilops tauschii ssp. strangulata)进行了HiFi测序，三份样品的测序覆盖率分别为1.7×、2.7×和6.6×，基于此生成小麦SV调用集（图2）。然后对上述3份小麦材料进行全基因组测序，测序深度分别为17x、14x和25x（图2c, f），结合Sanger测序（图2g, h）一同验证其SV检测的准确性。
图 2. 验证SV参考数据集。参考数据集中缺失和插入的数量（a， d）和基因组分布（b， e）。SV参考数据集中共有91.76%的缺失和81.71%的插入通过基于组装的SV调用集 （c、f） 进行验证。Sanger测序结果显示了两个250 bp缺失和270 bp插入的例子，具有精确的SV断点（g， h）。
然后对主流长读长对齐算法(pbmm2、NGMLR、Winnowmap2和Minimap2)和SV调用算法(pbSV、cuteSV、SVIM、SVDSS和Sniffles2)在SV检测中的表现进行了全面评估。结果表明，缺失检测的准确性受到调用算法的显著影响，占方差的87.73%，而插入检测的准确性同时受对齐算法(38.25%)和调用算法(49.32%)的影响。对齐算法中，Winnowmap2和NGMLR分别在检测缺失和插入方面表现突出（图3c, f）。对于SV调用算法，SVIM的性能最好（图3）。研究人员证明，结合上述对齐算法和调用算法是SV检测的最佳选择。
图 3. 长读长对齐算法和SV调用算法组合的性能表现
用于SV发现的skim HiFi测序
由于测序覆盖率和SNP调用准确性之间存在公认的权衡，因此使用NGS检测SNP的高准确性需要足够高的覆盖率来保证。然而，考虑到PacBio长读长测序的随机插入错误在HiFi测序模式中已经得到解决，研究人员推测HiFi测序的覆盖范围可能不会强烈影响SV调用的假阳性率。为了验证这一假设，研究人员对以6.6 x覆盖率测序的二倍体节节麦(Aegilops tauschii ssp. strangulata)的HiFi reads进行了下采样，以检验20个对齐算法-调用算法组合（ACCs）在不同测序深度水平（从0.33X到6.60X）下的表现。通过将这些SV调用集与SV参考数据集进行基准测试，结果表明召回率随着测序深度的增加而提高（图4a,c）。然而，对于所有20个ACCs，精度并没有随着覆盖范围的增加而增加。相反，随着覆盖率的增加，有些ACCs的精度略有下降（图4b,d），这可能是由于单个reads的对齐不一致造成的。这些发现表明，虽然skim HiFi测序可能会出现技术数据缺失（单个样本SV检测不全），但它不会影响检测到的SV的有效性。
考虑到许多遗传变异（包括SVs）是个体间是共有的，在一个个体中未检测到的SVs可以在群体中其他个体中检测到。因此，skim HiF测序成为在种群水平上研究SV的理想方法。
图4. 评估用于 SV 发现的低覆盖度 HiFi 测序。精确率 （a， c） 和召回率 （b， d） 显示了从0.33X到6.60X的测序深度的影响。
敲重点！
长读长测序的高覆盖率对于高置信度SV的发现至关重要。例如，ONT测序需要至少8倍的人类基因组覆盖率才能达到0.8的准确率。相比之下，HiFi测序以其高度准确的reads（90%≥99.9%）彻底改变了该领域，显着增强了SV检测。尽管如此，HiFi 测序的高成本为其在群体规模上的应用带来了挑战，特别是对于小麦等大型和复杂的基因组。因此，低覆盖度HiFi测序成为一种有吸引力的解决方案，支持在大量群体中进行SV研究。
讨论
该研究首次展示了在植物中使用HiFi测序进行主流SV对齐算法和调用算法的评估。通过引入广泛适用的工作流程来评估SV检测算法，发现
1）用每种SV类型得到最佳对齐算法和调用算法的组合可以提高SV发现的准确性；
2） 低覆盖率HiFi测序可以在SV检出中提供高精度SV的检测，这表明skim HiFi测序对于大规模、群体水平的SV研究是可行的。
综上所述，本研究的见解有望促进对小麦和其他植物中SV功能的研究。
参考文献：Zhang, Z., Zhang, J., Kang, L., Qiu, X., Xu, S., Xu, J., Guo, Y., Niu, Z., Niu, B., Bi, A., Zhao, X., Xu, D., Wang, J., Yin, C. and Lu, F. (2024), Structural variation discovery in wheat using PacBio high-fidelity sequencing. Plant J. https://doi.org/10.1111/tpj.17011
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