“概要”
富含鸟嘌呤 (G) 与胞嘧啶 (C) 的序列 (GC-rich序列) 通常出现在转录调控区域等的基因组上功能重要的位置。而GC-rich序列往往会阻碍PCR或测序过程中聚合酶的延伸反应，导致无法获得目标产物或序列。这种现象是由于G-C形成的碱基对比A-T更稳定，双链DNA不能很好地被解链。因此，在对GC-rich序列进行PCR或测序时，可添加促进DNA解链的PCR添加剂，如甲酰胺 (FA) 与甜菜碱 [1,2]。
在此实验中，以GC-rich序列为目的序列，对FA与甜菜碱的浓度及添加时间进行了研究。结果表明，通过添加PCR添加剂，即使在GC含量高于70%的情况下，也可获得PCR产物。但同时，如果在测序中添加PCR添加剂，不仅会降低信号强度，还会在波形数据中混入干扰峰，碱基的错误读取也有所增加。
“结果”
PCR添加剂对GC-rich序列扩增的影响
根据表3所示加入PCR添加剂并扩增CEBPA及RB，测定所得PCR产物的纯度(图1)：
1. 在CEBPA中，未添加PCR添加剂时，仅可扩增约1,000 bp的错误产物，非目标产物(587 bp)；添加不同PCR添加剂后，均可获得587 bp的目标PCR产物。
2. 在RB中，不添加PCR添加剂可获得PCR目标产物(466 bp)。如果添加甜菜碱与FA(3%)，可提高PCR目的产物的量(图1)。
图1. 确定PCR产物
使用Agilent D1000 ScreenTape System(安捷伦技术)分析PCR反应后的溶液。黑框表示正确的PCR产物条带。在CEBPA中，未添加PCR添加物的样品(图中的“无”)，在RB中FA10%的样品未能获得正确的PCR产物。根据左端的DNA梯形电泳图确认了PCR产物的碱基长度。
PCR添加剂对GC-rich序列循环测序反应的影响
如图6所示，以添加甜菜碱扩增的CEBPA作为样品在DS3000上进行循环测序。如图如图2所示，可以得到清晰的波形图。
图2. GC-rich序列的峰波形
显示了模板DNA使用CEBPA的样品的电泳图。图2是使用sangerseqR (参考文献4) 绘出，并使用Illustrator (奥多比系统) 来追加记载信息。横轴的碱基长度将与序列引物3’末端相邻的碱基计数为1。
接着，继续在循环测序反应中比较了不同PCR添加剂的效果。
图3是对各个条件下的QV20CRL(Contiguous Read Length，每20个碱基的QV的平均值)进行的比较。在桑格序列中，根据电泳获得的峰的颜色与波形推定碱基。当QV值为20时，推定的碱基的信赖性为99%。从图3中可看到由于PCR添加剂会降低QV20CRL值。
因此，上述结果表明，在测序环节添加PCR添加剂会降低反应产物的质量。
QV20CRL是表示循环数据质量的指标，是指在电泳中得到的碱基序列中，表示可高度信赖区域的碱基长度的指标。在RB中，所有条件下的QV20CRL均短于CEBPA。
这是由于RB的PCR产物(466 bp)短于CEBPA(587 bp)的缘故。柱状图显示了8次试行的平均值，误差棒表示标准偏差。
此外，对CEBPA的100-300 nt区域的峰波形进行比较(图4)。添加甜菜碱后，信号强度降低到1/10左右。结果是样品的峰与干扰峰重叠，发生了读取错误(图4、黑框部分)。在RB中也观察到相同的倾向(data not shown)。
图4. 峰波形的比较
显示以CEBPA为模板得到的峰波形。所使用的PCR添加剂如图中所记载。红色阴影部分是发生读取错误的区域。箭头表示黑框部分的放大图。
序列读取精度的比较
对比不同情况下的波形图，发现读取精度在100 nt附近降低(图5)。这是由于混入染料终止剂造成峰波紊乱(参考文献3)。建议可以使用市售的纯化试剂盒对上机测序前的DNA进行可能存在的染料终止剂的去除（例，BigDye Xterminator Purification Kit，Thermo Fisher Scientific）。
图5. 每个碱基长度的读取精度
在各条件下分别实施8次序列测试，将获得的每20个碱基碱基与正确序列一致的比例汇总后进行了比较。
“结论”
PCR添加剂，已被证实可提高PCR反应的效率。但在循环测序反应中会造成数据质量下降。因此，如果GC-rich序列在扩增或者测序中未能获得预期质量的数据，可以考虑使用PCR添加剂。操作时推荐参考本资料来调整PCR添加剂的种类、浓度和添加时间，以及酌情使用纯化试剂盒去除PCR添加剂的影响。
“实验方法”
样品调制
循环测序反应
根据表5～7实施循环测序反应。反应后，用乙醇沉淀除去剩余的染料终止剂与盐。
电泳
按表8所示条件在DS3000上实施sanger测序。
参考文献：
1. Grassi M., Volpe E., Colizzi V., & Miriani F. An improved, real-time PCR assay for the detection of GC-rich and low abundance templates of Mycobacterium tuberculosis testing. J. Microbiol. Methods. 64, 406-410 (2006)
2. Henke W., Herdel K., Jung K., Schnorr D., & Loening S., A. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997)
3. “HTB-DS-TS-J001 100 bases 附近出现干扰峰”
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4. Hill, J., T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243, 1632-1636 (2014)
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