【综述】抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎动物模型的研究进展

 摘要 　

抗N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）脑炎是一类严重的自身免疫性神经精神疾病。当前研究提示自身免疫性抗体的致病性可能是抗NMDAR脑炎的关键机制，但更深层次的发病机制尚未阐明。建立理想的动物模型有助于深入揭示抗NMDAR脑炎的潜在致病机制并探究有效的治疗靶点。近年来，不断有关于抗NMDAR脑炎的动物模型报道，本文综述了近年来已报道的抗NMDAR脑炎动物模型的基本特点及研究应用，旨在为进一步探究抗NMDAR脑炎的发病机制及治疗靶点提供参考。

抗N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptors, NMDAR）脑炎是一类严重的自身免疫性神经精神疾病，常以迅速进展的精神行为异常、认知功能下降、癫痫发作、言语或运动障碍及意识水平下降为主要临床表现^[1-2]。该疾病的治疗以免疫治疗为主，多数抗NMDAR脑炎患者对于免疫治疗反应良好，部分重症患者预后不良，严重者甚至死亡。以往研究提示抗NMDAR脑炎患者复发率在12.0%～31.4%之间，部分患者可出现多次复发，严重影响患者的身体健康和生活品质^[3-4]。当前研究认为肿瘤（常为卵巢畸胎瘤）和单纯疱疹病毒感染是抗NMDAR脑炎的已知主要诱因。虽有研究提示自身免疫性抗体的致病性可能是抗NMDAR脑炎的关键机制，但仍需更深入的研究阐明其发病机制^[5-6]。动物模型的研究在揭示神经精神疾病的发病机制方面起到至关重要的作用^[7]。建立理想的动物模型有助于深入揭示抗NMDAR脑炎的潜在致病机制并探究有效的治疗靶点。近年来，不断有关于抗NMDAR脑炎的动物模型报道，主要包括4类：被动免疫模型、主动免疫模型、病毒感染诱导模型及遗传性模型^[8-9]。本文将综述近年来国内外学者开发的抗NMDAR脑炎动物模型的基本特点及研究应用，旨在为抗NMDAR脑炎的进一步研究提供参考。

被动免疫模型构建的理论基础是通过转移血清、纯化免疫球蛋白、单克隆抗体，或从受影响的人类或动物供体分离的抗体产生细胞，在健康受体中复制疾病^[10-11]。在抗NMDAR脑炎动物模型的构建中，此类模型通常通过体内输注或立体定向脑室注射抗 NMDAR脑炎患者的脑脊液或从患者的血清和（或）脑脊液纯化的IgG进行制备。

最早的抗NMDAR脑炎被动免疫模型由Planagumà等^[12]通过输注来自患者的脑脊液被动转移NMDAR抗体建立。输注抗NMDAR脑炎患者脑脊液的小鼠重现了在患者身上观察到的一些神经精神特征，如记忆障碍、快感缺失和抑郁样行为，未观察到癫痫发作或运动障碍。免疫印迹和共聚焦显微镜显示海马NMDAR总蛋白以及总受体和突触受体聚集减少，进一步证实NMDAR与观察到的症状的相关性。该小鼠模型不仅揭示了NMDAR抗体的直接致病性，还为研究突触功能障碍的机制提供了依据。Planagumà等开发的动物模型将有助于阐明NMDAR抗体在自身免疫性脑炎中的分子效应，并有助于探究NMDAR抗体影响认知及情绪的作用机制。Wright等^[13]通过脑室注射抗NMDAR脑炎患者的纯化NMDAR IgG结合化学致惊厥剂戊四氮构建小鼠模型，该小鼠模型出现反复的癫痫发作，但没有出现认知和其他特征的改变。该项研究证明了NMDAR抗体在体内的致痫性。

2016年Wurdemann等^[14]将商品化的抗NMDAR及来自抗NMDAR脑炎患者的脑脊液的抗NMDAR立体定向注射到成年雌性大鼠的齿状回中成功制备被动免疫大鼠模型，该模型大鼠在Morris水迷宫隐藏平台任务中的学习表现显著受损，没有出现焦虑及抑郁等精神症状及癫痫发作，该模型在一定程度上重现抗NMDAR脑炎患者病程中的认知功能下降症状，进一步体外实验发现来自用抗NMDAR处理的动物的齿状回颗粒细胞显示NMDAR介导的兴奋性突触后电位（EPSP）的幅度显著降低，为探究抗NMDAR脑炎患者的记忆力下降的发生机制及突触的病理改变机制的研究提供了动物模型保障。

Malviya等^[15]于2017年的研究中将人重组GluN1特异性单克隆抗体进行小鼠脑室内输注后，小鼠出现严重的记忆障碍，并且引起海马突触NMDAR密度降低，该研究证实抗NMDAR脑炎中存在CNS特异性体液免疫应答并且特异性靶向NMDAR的GluN1亚单位。该动物模型以重组的形式恢复了典型的鞘内抗体特征，并通过被动转移疾病症状证明了其致病相关性，为阐明鞘内免疫应答介导抗NMDAR脑炎的发生发展提供了关键证据。此外，鉴于抗NMDAR脑炎患者的脑脊液或血清来源及数量有限，使用重组GluN1特异性单克隆抗体构建动物模型为研究者进一步探究自身免疫性脑炎的发病机制提供了限制较少的有潜力的动物模型构建途径。

被动免疫动物模型通过将抗体被动转移至动物体内能在一定程度上重现抗NMDAR脑炎病程中出现的认知功能障碍、癫痫发作及抑郁样症状等主要临床表现及突触功能障碍的病理改变，为深入了解抗NMDAR脑炎的潜在致病机制提供了条件，但是该类模型对探讨免疫启动因素和免疫细胞浸润以及神经炎症在抗NMDAR脑炎过程中的潜在作用机制方面作用有限，因此进一步开发其他类型的动物模型是有必要的。

主动免疫动物模型构建的理论基础基于机体接触抗原后诱导产生适应性免疫反应^[16-17]。抗原可以是纯化蛋白质、重组或合成肽的形式。Jones等^[18]通过使用嵌入脂质体中的GluN1-GluN2B四聚体组成的完整的NMDA受体进行免疫建立抗NMDAR脑炎主动免疫小鼠模型。该研究将含有NMDA受体的蛋白脂质体皮下注射给小鼠后诱导出多动、刻板运动（密集旋转）、癫痫发作及嗜睡等类似人类抗NMDAR脑炎发病症状的表现。体外实验证实所有蛋白脂质体处理的小鼠在免疫后6周均存在GluN1和GluN2B抗体，提示蛋白脂质体免疫可能诱导机体出现多克隆反应，该研究认为GluN1亚基的细胞外氨基末端结构域（ATD）特别是N368/G369区域是作为免疫反应性所必需的。进一步研究发现免疫后6周模型小鼠在海马、纹状体及丘脑等部位出现明显的神经炎症和免疫细胞浸润的组织学特征，免疫细胞以激活的巨噬细胞/小胶质细胞（Galectin3＋）、浆细胞（CD138＋）、辅助性T细胞（CD4＋）、B细胞（CD20＋）为主，并证实B细胞和T细胞是蛋白脂质体诱导的脑炎所必需的。该模型通过使用完整的NMDA受体蛋白主动免疫诱导小鼠出现暴发性脑炎，重现人类抗NMDAR脑炎的多种核心症状及组织病理学表现，类似于人类疾病的急性期，该模型为进一步探究神经炎症及免疫因素在抗NMDAR脑炎发病中的潜在机制和新的治疗方法提供了良好的体内模型。

鉴于GluN1亚基的细胞外氨基末端结构域在免疫反应中的重要性，国内外学者不断进行针对主动免疫动物模型的探索^[18-20]。在2020年，Wagnon等^[5]的研究中使用针对GluN1 359-378区域的肽段免疫小鼠，该免疫小鼠出现认知、情绪和行为障碍等人类抗NMDAR脑炎的典型症状，并观察到脑膜及脑室周围空间的B淋巴细胞浸润，进一步通过阻断B细胞应答降低脑炎小鼠症状的严重程度，提示B淋巴细胞反应可导致针对NMDAR的自身免疫反应。Ding等^[20]通过皮下注射针对GluN1 ATD的GluN1 356-385肽的主动免疫诱导高滴度的致病性抗GluN1自身抗体成功建立抗NMDAR脑炎主动免疫小鼠模型。此免疫小鼠主要表现为记忆障碍，并未表现出如情绪障碍或自发性癫痫发作等其他抗NMDAR脑炎的癫痫症状。上述主动免疫模型的建立进一步证实了GluN1亚基的细胞外氨基末端结构域的致病性，并为进一步探究NMDAR抗体在体内的作用机制提供了条件。

单纯疱疹病毒（HSV）感染被认为是已知的抗NMDAR脑炎诱因之一，以往研究发现复发的HSV脑炎患者血清和（或）脑脊液中检测到NMDAR抗体，表明新的神经症状与自身免疫性脑炎相符^[8,21]。随后的另一项研究发现27%的HSV患者会发生自身免疫性脑炎，通常与NMDAR抗体有关^[22]。基于以上理论基础，Linnoila等^[23]首次通过经鼻接种HSV成功诱导出抗NMDAR脑炎小鼠模型。在此项研究中小鼠经鼻接种HSV-1后用阿昔洛韦（ACV）治疗2周，经检测2/3的小鼠产生了血清NMDAR抗体：1只在注射后3周、1只在6周和2只在注射后8周。免疫荧光染色显示，血清NMDAR抗体阳性的小鼠海马突触后膜NMDAR簇数量减少，该研究未对诱导小鼠出现的主要症状进行描述。该模型为在体内条件下阐明病毒感染等触发因素及免疫机制在抗NMDAR脑炎中的潜在致病机制提供了可能。

遗传性动物模型通常通过NMDAR的编码基因进行基因编辑实现^[24-25]。功能性NMDAR由1个共同的NR1亚基和4个NR2亚基之一（NR2A-NR2D）以不确定的比例组合而成，形成异聚受体复合物，抑制性NR3亚基也可能存在于受体复合物中^[26]。NMDAR由于其独特的电生理学特性以及其在突触精细化及神经元可塑性中的作用被研究者广泛关注。在以往的研究中，缺失各类NMDAR亚基的基因编辑小鼠模型陆续被报道^[24,27-28]。将GRIN1（编码NMDAR的NR1亚基）敲低至表达量为正常小鼠表达水平的5%～10%时，GRIN1敲低小鼠可存活至成年，并出现多动、刻板运动障碍及精神行为异常等症状^[24]。选择性敲除海马CA1和CA3区锥体细胞中的NR1会引起小鼠空间记忆功能下降^[27-28]。此类模型主要用于探究NMDAR相关疾病的发病机制，由于其症状较为单一且操作相对复杂，当前在抗NMDAR脑炎的发病机制研究中应用尚不多。

抗NMDAR脑炎是一种严重的神经免疫性疾病，阐明其发病机制并发现新的治疗靶点是当前国内外研究的热点和难点。建立理想的动物模型对于相关研究的开展意义重大。目前抗NMDAR脑炎尚无公认的动物模型，已报道的动物模型存在一定的局限性，尚不能很好模拟人类抗NMDAR脑炎的症状及病理特点。因此，为了更好的模拟人类抗NMDAR脑炎的临床症状、病理改变及发生机制，仍需构建更为理想的动物模型用于抗NMDAR脑炎的研究。

参考文献（略）