【基础研究】抗NMDA受体脑炎相关癫痫小鼠脑组织小胶质细胞及IL-1β、TNF-α表达的变化

 摘要 　

目的  探讨抗NMDA受体脑炎相关癫痫小鼠海马组织的小胶质细胞及其相关炎症因子的改变。方法  选取雄性C57BL/6J小鼠构建抗N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体脑炎相关癫痫小鼠模型，麻醉处死后取脑组织，应用尼氏染色观察小鼠大脑神经元细胞形态变化；ELISA检测小鼠海马组织中炎症因子IL-1β、TNF-α表达水平；蛋白印迹法检测IBA1、iNOS及Arg-1蛋白的表达水平。结果  模型组小鼠中有3只死亡，死亡率为27%。尼氏染色显示模型组小鼠脑组织中部分神经元细胞变性坏死，细胞形态不完整，细胞肿胀或皱缩，轮廓模糊，界限不清。ELISA显示与对照组比较，模型组海马组织中炎症因子IL-1β、TNF-α均增高（P＜0.05）。蛋白印迹法提示IBA1、iNOS显著增高（P＜0.05），Arg-1和p-p38均减少（P＜0.05）。结论  抗NMDA受体脑炎相关癫痫可导致神经元损伤，激活M1型小胶质细胞，上调IL-1β、TNF-α表达水平。

随着抗体检测的普及，临床上证明，自身免疫性癫痫（autoimmune epilepsy, AE）在癫痫中占相当一部分比例，对抗癫痫药物不敏感的患者，免疫疗法可能有效，说明这种癫痫与自身免疫性疾病相关^[1]。2017年国际抗癫痫联盟（ILAE）对AE的定义是：它直接由一种免疫性疾病引起，并且癫痫发作是这种疾病的核心症状^[2]。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）受体抗体是AE最常见的神经特异性抗体之一，所致癫痫发作的临床表现复杂多样，癫痫发作的预后与患者免疫反应进程存在密切联系。

小胶质细胞作为中枢神经系统的主要免疫细胞，在发育期和成年期的神经回路的发展和维护中与神经元形成、存活及吞噬有着密切的关系^[3]。小胶质细胞的激活是一个动态变化的过程，在癫痫的发生发展中起重要作用^[4-5]。越来越多的证据表明，小胶质细胞在中枢神经系统的激活可分为2种相反的类型：M1型和M2型。根据激活的表型，小胶质细胞可以产生细胞毒性或神经保护作用^[6]。但对癫痫和（或）癫痫发作过程中的这种小胶质细胞的研究不多。本研究参照文献^[7]的造模方法，以NMDA受体抗体介导的AE小鼠为研究对象，观察癫痫发作情况并探索M1/M2型小胶质细胞的活化和相关炎症因子TNF-α、IL-1β的表达变化。

1.1　动物来源

选取健康清洁级成年雄性C57BL/6J小鼠共17只，8周龄，体质量约18～22 g，饲养环境温度为（21±1）℃，湿度（55±10）%，周围光线明暗周期为12 h交替进行（光期：晚上7点到早上7点），食物和水源供应充足。C57BL/6J小鼠由广西医科大学动物实验中心提供，实验过程均按动物研究伦理学要求进行。

1.2　主要仪器及试剂

合成肽GluN1359-378（购于卓一生物）；结核分枝杆菌H37Ra（购于BDDS）；完全弗氏佐剂（购于Sigma Aldrich Laboratory）；小鼠TNF-α、IL-1β酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（购于Boster Biological Technology）；兔抗鼠IBA-1单克隆抗体（购于Sigma Aldrich Laboratory）；兔抗鼠Arg1单克隆抗体（购于Boster Biological Technology）；兔抗INOS单克隆抗体（购于Boster Biological Technology）；兔抗鼠p-p38单克隆抗体（购于Boster Biological Technology）；兔抗鼠GADPH单克隆抗体（购于Sigma Aldrich Laboratory）。 

1.3　方法

1.3.1　动物分组

小鼠随机分为2组：抗NMDA受体脑炎相关癫痫组（11只，模型组）；正常对照组（6只）。模型组8周龄雄性C57BL/6J小鼠皮下注射200 µg多肽GluN1359-378（溶于100 µL PBS溶液）与含有600 µg结核分枝杆菌H37Ra的完全弗氏佐剂乳剂混合物，体积比1∶1，该乳剂分4次注射到四肢，每次50 µL，诱导自身免疫应答。所有模型组小鼠在免疫时和免疫后48 h，腹腔注射含有200 ng百日咳杆菌毒素的200 µL 生理盐水。免疫2周后，模型组小鼠腹腔注射戊四氮（PTZ）50 mg/kg。对照组用同等剂量生理盐水代替乳剂、百日咳杆菌毒素和PTZ。

1.3.2　动物行为学观察

观察记录小鼠体质量及痫性发作情况。根据Racine分级标准：0级为无惊厥；Ⅰ级为面部阵挛；Ⅱ级为面部阵挛＋节律性点头；Ⅲ级为面部阵挛＋节律性点头＋前肢阵挛；Ⅳ级为面部阵挛＋节律性点头＋前肢阵挛＋后肢站立；Ⅴ级为面部阵挛＋节律性点头＋前肢阵挛＋后肢站立＋跌倒。根据Racine分级，选择Ⅳ～Ⅴ级致痫小鼠作为癫痫模型组^[8]。

1.3.3　海马神经元细胞形态变化

小鼠断头取脑，以4%（质量浓度）多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片（片厚4 µm），二甲苯透明、酒精脱水，Nissl染色液37 ℃染色30 min，水洗，风干，二甲苯透明，中性树胶封片，置显微镜下观察神经元形态。

1.3.4　海马组织中TNF-α、IL-1β测定

取3只小鼠断头取脑，快速剥离海马组织，该操作于冰面上完成，置于－80 ℃冰箱储存待用。提取海马组织蛋白后，按ELISA试剂盒操作说明分别测量海马组织中IL-1β及TNF-α细胞因子水平。

1.3.5　Western blot检测海马组织中IBA-1、Arg-1、iNOS蛋白的表达水平

各组取适量海马组织于高效RIPA蛋白裂解液和PMSF混合液中充分裂解30 min提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加Loading Buffer煮沸后取25 µg蛋白上样，SDS-PAGE分离转移至NC膜，快速封闭液室温封闭20 min，加入相应的一抗置于4 ℃冰箱过夜，次日TBST洗膜后加入带HRP荧光标记山羊抗兔二抗（1∶10 000）于室温孵育1 h，TBST洗膜后系统成像，以Image J软件分析条带灰度值，计算目的蛋白与内参蛋白GAPDH的比值以及各组目的蛋白条带的比值，进行定量分析。

1.4　统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件作统计学分析，Graph Pad Prism 5对数据进行作图，数据以均数±标准差表示，采用单因素方差（one-way ANOVA）分析组间差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1　动物行为学观察

第7天和第14天对照组和模型组小鼠体质量比较差异无统计学意义（第7天：t＝0.682，P＞0.05；第14天：t＝－0.624，P＞0.05）。结果详见表1。对照组小鼠未见自发的癫痫痫性症状发作，第14天脑电图（EEG）以不规则基础波为主（图1）。第14天模型组小鼠出现咀嚼、点头的痫性症状，EEG监测可见散在的痫性波（图1）。第14天模型组注射PTZ后11只小鼠均出现Ⅳ级以上发作，发作率为100%，死亡4只，死亡率为36%。

2.2　海马神经元细胞形态和存活的变化

对照组小鼠海马CA1、CA2及DG区可见神经元排列整齐，形态规则完整，染色质分布均匀；尼氏染色均匀。与对照组比较，模型组小鼠海马CA1、CA2及DG区尼氏染色均出现减弱，部分神经元细胞变性坏死，细胞形态不完整，细胞肿胀或皱缩，轮廓模糊，界限不清；细胞间距增加，排列疏松紊乱（图2）。

2.3　对照组与模型组海马组织中炎性因子TNF-α、IL-1β的比较

与对照组比较，模型组小鼠海马组织中TNF-α、IL-1β因子均显著增高，差异有统计学意义（t＝－3.58，P＜0.05）。结果详表2。

2.4　对照组与模型组海马组织中IBA-1、Arg-1、iNOS蛋白水平的比较 

与对照组比较，模型组小鼠的海马组织中，IBA-1、iNOS显著增高，差异有统计学意义（IBA-1：t＝－4.85，P＜0.05；iNOS：t＝－3.00，P＜0.05），p-p38减少，差异有统计学意义（t＝2.93，P＜0.05），Arg-1减少，差异无统计学意义（t＝－2.40；P＞0.05，图3）。

抗NMDA受体脑炎是最常见的自身免疫性脑炎，约占自身免疫性脑炎的80%^[9]，癫痫发作是脑炎最常见的症状之一，然而导致抗NMDA受体脑炎相关癫痫的机制目前尚不清楚，为进一步探讨，本研究制作了抗NMDA受体脑炎相关癫痫小鼠模型，基于该模型小鼠海马组织小胶质细胞极性的改变，为自身免疫性脑炎癫痫发作所致的炎症损伤提供理论依据。本研究结果提示，模型组小鼠EEG检测到异常放电，海马组织的神经元细胞受损，小胶质细胞和M1型小胶质细胞表达较对照组增加，炎症因子IL-1β和TNF-α明显增多。

通常抗NMDA受体脑炎患者EEG都有异常放电，表现为弥漫性慢波、过度活动β波、极度δ刷和全面性节律活动δ波，EEG的正常与否不但影响着患者的预后，而且影响着癫痫的复发概率^[10-11]。本实验中模型组小鼠EEG检测到异常的神经元放电，表现为痫性波，这与临床研究相一致，81.2%的自身免疫性脑炎患者伴有癫痫发作的症状^[12]。同时本研究中抗NMDA受体脑炎相关癫痫小鼠海马组织CA1、CA2及DG区出现部分神经元细胞变性坏死，这可能是因为NMDA受体的活化介导兴奋性神经毒性，引起神经元损伤，损伤的神经元增加了神经元的兴奋性，诱发癫痫发作，所以小鼠出现咀嚼及点头等痫性症状，EEG存在痫性波。然而本实验中小鼠EEG没有表现出抗NMDA受体脑炎患者经典的δ刷波形，可能与患病病程有关^[13]。

IL-1β及TNF-α是中枢神经系统中最常见的炎症因子，有研究显示，癫痫发作可引起大脑中炎症因子IL-1β水平升高、海马中的TNF-α和IL-1β mRNA表达上调^[14-15]，本研究结果提示，小鼠海马组织中炎症因子IL-1β及TNF-α表达水平增高，说明脑部产生了具有炎症特性的分子免疫反应。神经元在受到损害、感染等刺激时通常可引起小胶质细胞的激活、增生^[16]，激活的小胶质细胞释放促炎细胞因子，增强炎性相关基因的表达^[15]。小胶质细胞活化后可以呈现两种激活状态：经典活化状态M1型和选择活化状态M2型^[6,17]。M1型小胶质细胞主要表达的是促炎型小胶质细胞，释放如IL-1β、TNF-α及NO等，表达标志物一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）；M2型小胶质细胞则表达抑炎性因子，包括IL-10、IL-13、转化生长因子-β、血管内皮生长因子、内皮生长因子及精氨酸1（Arginase 1, Arg-1）等^[6,18]，表达标志物Arg-1。本实验中模型组小鼠海马组织中蛋白IBA-1表达明显增加，神经元受到了刺激而引起小胶质细胞的活化。同时模型组小鼠海马组织中iNOS表达明显增高，M1型小胶质细胞大量激活，Arg-1蛋白表达与对照组比较没有明显变化，抑制炎症反应的M2型小胶质细胞没有明显激活或抑制。这说明该模型可能是以激活的经典活化状态M1型小胶质细胞为主，这与Davies等^[9]的研究一致。而激活的M1型小胶质细胞表现为促进炎症因子如IL-1β、TNF-α的释放^[6]。以上说明了抗NMDA受体脑炎相关癫痫发作同样有这样的表现，抗NMDA受体抗体和癫痫的发作刺激中枢神经系统，激活小胶质细胞，炎症反应激活，促进M1型小胶质细胞活化，促进炎症因子IL-1β及TNF-α的释放。

炎症反应有多种激活途径，p38丝裂素活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase, p38MAPK）是其中之一。p38MAPK是丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）家族成员之一，可以通过调节促炎性因子IL-1β及TNF-α等的分泌，影响神经炎症反应的发生发展^[19]。在其他各种疾病中发现激活p38MAPK信号通路可以使IL-1β、TNF-α大量分泌^[20-21]。既往研究表明，参与小胶质细胞激活的信号通路有很多^[22-23]，p38就是其中之一，促进p38MAPK蛋白磷酸化可以激活M1型小胶质细胞，释放炎症因子^[24]。然而本实验中与之不同的是，模型组小鼠海马组织磷酸化p38减少，小胶质细胞和M1型小胶质细胞却仍然被激活，IL-1β、TNF-α分泌增多，推测抗NMDA受体脑炎相关癫痫模型中，磷酸化p38减少可能跟NMDA受体激活钙激活/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium-activated/calmodulindependent protein kinase Ⅱ, CamK Ⅱ）和SynGAP-MUPP1有关^[25]。

通过本次研究表明，抗NMDA受体脑炎相关癫痫小鼠海马组织中神经元受损伤，小胶质细胞活化，M1型小胶质细胞激活，释放炎症因子IL-1β及TNF-α。

参考文献（略）