Front. Cell Dev. Biol：激活哺乳动物胚胎发育的信号

近期，Frontiers in Cell and Developmental Biology发表了题为The signal that stimulates mammalian embryo development的综述。该综述回顾了卵子形成的主要步骤，讨论了产生Ca²⁺信号所必需的信号toolkits，并描述了激活卵子发育程序并将其转化为胚胎的信号转导机制的步骤。

卵子发生主要有卵母细胞形成、生长和成熟三个阶段。发育完全的卵母细胞到达受精部位时，能够对受精精子做出适当的反应。卵母细胞需要激活才能成为胚胎，激活是由涉及Ca²⁺的信号机制介导的。这个重要的第二信使从卵子的细胞内储存中释放出来，一旦进入细胞质，它就会与信号级联的下游成分相互作用，阻止额外的精子进入卵子细胞，以防止多精受精，接着减数分裂完成和新形成胚胎的第一个有丝分裂细胞周期的开始。

生物体的细胞选择游离钙离子进行信号传导是因为1）它们的浓度必须能够随时间波动，即在静息细胞中的水平很低，但在需要时迅速产生和释放，2）它们必须能够影响蛋白质的功能。Ca²⁺可以满足这两个要求。细胞花费大量能量来保持其细胞内Ca²⁺水平比细胞外环境低约20000倍，因此它们可以通过快速增加细胞质中的Ca²⁺水平来产生信号。此外，蛋白质的功能取决于形状和电荷，Ca²⁺可以通过与蛋白质结合来改变这些特征。由于这些特性，Ca²⁺成为参与各种生物过程的生物体中最普遍的信号转导元件。

在信号传导过程中，储存在内质网中的Ca²⁺通过两种类型的通道受体释放，即IP3Rs和ryanodine受体。在哺乳动物细胞中，IP3R占主导地位。受体有四个亚基，横跨ER膜并形成通道孔。有三种IP3R亚型（IP3R1、IP3R2和IP3R3），性质略有不同；哺乳动物卵绝大多数表达IP3R1，尽管它们也有其他亚型。IP3R的打开需要IP3和Ca²⁺的结合，低细胞溶质Ca²⁺水平刺激储存的Ca²⁺的释放。

激活卵子的精子蛋白

精子如何激活卵子？卵激活是一个化学过程，它涉及卵细胞质中离子浓度的变化。后来证实，受精精子通过刺激卵子细胞质游离Ca²⁺浓度的增加来激活卵子的发育程序。然后，主要的问题变成了精子如何导致卵子中Ca²⁺的变化。很明显，Ca²⁺来自内部，并且IP3刺激了其释放。经过几十年的深入研究，普遍的假设是精子与卵子表面的跨膜受体结合，从而刺激磷脂酶C酶产生IP3。然而，精子可以结合的卵子表面受体，以及其刺激会导致IP3产生和Ca²⁺释放的受体，从未被发现。另一个主要思路是所谓的融合假说。对小鼠和海胆卵的实验表明，在精子与卵质膜结合后，两个配子在Ca²⁺释放之前发生融合。对此的解释是，精子可能含有一种扩散到卵细胞质中并导致Ca²⁺释放的因子。精子可能含有这种因子的第一个实验证据来自Dale等人的实验，这些实验表明，将精子提取物显微注射到海胆卵中会导致受精包膜的形成，这是卵子激活的迹象。后来证明，哺乳动物精子提取物也可以诱导小鼠、兔子和仓鼠卵的激活。重要的是，哺乳动物精子提取物还能够引发各种物种卵子中重复的Ca²⁺振荡，包括仓鼠、小鼠、人类、牛和猪。

鉴定精子因子的一个重要步骤是发现哺乳动物精子提取物含有磷脂酶C，其活性足以产生IP3以引起Ca²⁺振荡。这表明精子因子可能是PLC，尽管后续研究确定它与任何已知的PLC亚型都不同。该因子最终被确定为一种新的PLC亚型，称为PLCζ（PLCzeta），一种精子特异性蛋白。它存在于许多不同哺乳动物的精子中，其引起Ca²⁺振荡的能力在进化上是保守的。它的基因存在于迄今为止测序的所有哺乳动物基因组中，也存在于一些鸟类和鱼类中。PLCζ已被证明可以诱导小鼠、人类、猪和奶牛卵中的Ca²⁺振荡。该蛋白质定位在精子头部，并在精卵融合后扩散到卵子中，这解释了为什么在卵母细胞胞浆内单精子注射过程中将精子显微注射到卵子中会导致Ca²⁺振荡。它也存在于精子细胞质提取物中，已被证明在注射到卵子中后会刺激重复的Ca²⁺瞬变。这种蛋白质的具体位置在精子的顶体后区域，这是配子融合开始的地方。PLCζ在该区域的浓度可以刺激卵子中重复的Ca²⁺振荡。

其他精子蛋白也被提出作为可能的候选因子，包括顶体后鞘WW结构域结合蛋白（PAWP）、截短的c-kit酪氨酸激酶和线粒体外形式的柠檬酸合酶。这些蛋白质被认为会触发小鼠和人类卵子中Ca²⁺的释放和随后的激活。尽管仍有一些问题存在，但越来越多的证据表明，PLCζ目前是唯一满足所有要求的，被认为是主要的哺乳动物卵子激活因子。

受精时的钙信号

由精子递送到卵子中的PLCζ将PIP2水解成IP3和二酰基甘油（DAG）。IP3然后与ER表面的受体结合，导致储存的Ca²⁺释放到细胞质中，而DAG可以激活PKC酶。在哺乳动物物种中，最初的Ca²⁺升高之后是一系列持续数小时的瞬态。似乎需要持久的刺激来正确地激活卵子。有两个主要事件是由Ca²⁺触发的：皮质颗粒胞吐，以防止额外的精子细胞与卵子融合，以及刺激细胞周期恢复。严格控制卵中产生的Ca²⁺尖峰数量的实验结果表明，为了触发全面的皮质颗粒胞吐并诱导MII减数分裂停止，需要多次瞬态Ca²⁺峰。此外，与细胞周期恢复相比，刺激皮质颗粒释放所需的瞬变更少，这可能是因为从生理上讲，防止额外的精子细胞进入比刺激减数分裂完成更为紧迫。

配子融合后，IP3的水平也与Ca²⁺同步振荡。当使用IP3指示剂IRIS-2.3TMR监测小鼠卵中IP3浓度的变化时，发现在最初的几个Ca²⁺峰值期间，IP3有一个小的单调增加，然后在一系列Ca²⁺瞬变峰约20分钟后，IP3出现明显的振荡。这种转变与PLCζ的扩散特性是一致的。在最初的几个瞬态过程中，PLCζ定位在精子与卵质膜融合的区域，Ca²⁺峰值将主要取决于IP3扩散和IP3刺激。约20分钟后，PLCζ扩散到整个细胞质中，Ca²⁺瞬变将取决于Ca²⁺诱导的IP3产生，IP3水平与Ca²⁺振荡同步振荡。如上所述，Ca²⁺刺激的PLCζ水解PIP2产生IP3，IP3与ER上的受体结合，诱导储存的Ca2+释放。在Ca²⁺释放过程中的某一时刻，细胞质Ca²⁺水平的增加被终止，但有趣的是，尚不完全清楚是如何终止的，降低细胞质内Ca²⁺浓度的负反馈的机制尚不清楚。

Ca²⁺内流

Ca²⁺振荡的维持需要Ca²⁺内流穿过卵质膜来维持Ca²⁺振荡。在无Ca²⁺的培养基中，精子诱导或由PLCζ细胞质内注射引发的Ca²⁺振荡会减缓或完全停止。尽管卵子中Ca²⁺内流的机制已经确立，其在受精过程中的重要性也得到了明确的证明，但该途径的组成部分仍然难以捉摸。基质相互作用分子1（STIM1）蛋白被确定为ER Ca²⁺含量的传感器。此外SOCE通路的通道成分ORAI1被鉴定出来。这些蛋白质在受精过程中介导SOCE的存在和作用已在猪卵中得到证实。当使用siRNA受精前猪蛋中STIM1水平下调时，卵子只显示出一个Ca²⁺瞬变峰；在缺乏STIM1的卵子中无法检测到额外的Ca²⁺升高。同样，通过siRNA显微注射下调ORAI1表达似乎也会阻断精子诱导的Ca²⁺振荡。已发现STIM1和ORAI1介导的Ca²⁺进入对于维持猪卵子中的受精Ca²⁺信号至关重要，Förster共振能量转移（FRET）分析清楚地表明，STIM1和ORAI1在受精过程中的重复相互作用与精子诱导的Ca²⁺瞬变同步。这些数据强烈暗示，由STIM1和ORAI1之间的相互作用介导的储存操作的Ca²⁺进入在猪受精过程中起作用。

普遍接受的推理是，需要Ca²⁺内流来补充细胞内的Ca²⁺储存，这对下一次Ca²⁺振荡的发生很重要。然而，最近，根据PLCζ的Ca²⁺敏感性，提出了另一种解释。有人认为，在没有细胞外Ca²⁺的情况下，Ca²⁺瞬变的快速停止可能不是由于内质网中的Ca²⁺水平低，而是由于细胞质中Ca²⁺水平降低。过低的细胞质Ca²⁺水平可能不足以刺激PLCζ产生IP3。这一假设得到了使用SERCA泵抑制剂thapsigargin的实验结果的支持。关于Ca²⁺内流效应的这一替代解释也突显了其在受精过程中维持Ca²⁺振荡的重要性。

皮质颗粒胞吐

Ca²⁺刺激卵子激活的主要事件，皮质颗粒的胞吐，将皮质颗粒的内容物释放到卵黄周围空间，以防止多精受精。该过程似乎是由一个信号转导级联诱导的，该级联很可能涉及肌球蛋白轻链激酶（MLCK）。MLCK是Ca²⁺/钙调素依赖性蛋白激酶。从内质网释放后，Ca²⁺与细胞内Ca²⁺结合蛋白钙调素结合，该复合物可以激活包括MLCK在内的许多下游蛋白激酶。一旦激活，MLCK磷酸化（即激活）肌球蛋白的轻链，激活的肌球蛋白将能够与肌动蛋白相互作用。

有人认为，皮质颗粒内容物的分泌改变了透明带的性质，从而防止多余的精子进入卵黄周围空间。负责转化透明带的酶被认为是虾青素样金属内肽酶（Astl，也称为卵巢蛋白）。Astl部分降解ZP2蛋白，ZP2蛋白是透明带的一种成分，从而阻断了额外精子细胞的通过。在小鼠体外受精过程中，一旦前2或3个Ca²⁺瞬变完成，皮质反应和ZP2切割（透明带硬化）在精卵融合后约40分钟达到稳定状态。在透明带反应过程中，另一种透明带糖蛋白ZP3也被修饰，结果发现它失去了精子受体活性和诱导顶体反应的能力。透明带结构的这些变化阻止了额外的精子到达卵质膜，并最终保证了胚胎中的正常（即二倍体）染色体数量。

有趣的是，据报道，不同类型颗粒内容物的释放也在受精过程中发挥了作用。这些颗粒也位于质膜之下，并且具有高Zn²⁺含量。在Ca²⁺振荡期间，储存在颗粒中的Zn²⁺被释放到细胞外环境中。通过用Zn²⁺螯合剂处理卵子来人工消耗Zn²⁺储存，在没有Ca²⁺尖峰的情况下引起小鼠和猪卵子的激活，表明细胞内Zn²⁺在卵子第二次减数分裂阻滞中的重要性。这些所谓的锌通量似乎通过APC抑制剂Emi2（一种锌结合蛋白）调节减数分裂；锌螯合剂从Emi2中剥离Zn²⁺，从而导致减数分裂恢复。

减数分裂完成

Ca²⁺引发的另一个主要事件是减数分裂的恢复和最终完成。ER释放的Ca²⁺与钙调素结合，在这种情况下，钙调素会激活钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）的Ca²⁺感应酶。CAMKII的活性是振荡的，与受精卵中Ca²⁺的浓度短暂升高平行。CaMKII反过来激活Wee1b，一种酪氨酸蛋白激酶，通过磷酸化抑制Cdk1。CamKII还通过Polo样激酶1磷酸化并因此抑制APC抑制剂Emi2，当Emi2降解时，APC被激活。这能够破坏细胞周期蛋白B1和securin，从而刺激细胞周期进程。Cdk1的抑制和细胞周期蛋白B1的破坏意味着MPF失活。同时，securin的减少导致separase的激活，进而水解着丝粒粘聚蛋白，导致后期姐妹染色单体的分离。由于它涉及姐妹染色单体的分离，这种第二次细胞分裂是一种等式分裂，类似于有丝分裂。它也是不对称的（就像第一轮减数分裂一样），导致单细胞胚胎和第二极体的形成。减数分裂II期的完全完成需要核膜的重组和染色体的去浓缩，这意味着另一个信号--MAPK也需要被破坏。在MII阻滞期间，MAPK水平很高，高水平的MAPK活性被证明与原核包膜不同时存在。重复的Ca²⁺振荡导致MAPK的破坏，从而完成减数分裂II并形成原核。

因此，在生理条件下，振荡Ca²⁺信号的作用是提供足够长的信号时间窗口，以确保卵子退出减数分裂。重复信号的另一个功能似乎是它对长期胚胎发育的影响。当卵子在专门设计的激活环境中暴露于一系列不同幅度和持续时间的Ca²⁺升高时，它们都经历了高激活率。然而，它们的长期（即植入后）发育明显受到Ca²⁺振荡的影响，更多的Ca²⁺振荡对染色质重塑和基因表达的重编程有积极影响。据推测，重复的Ca²⁺振荡峰不仅对维持中期II期阻滞的蛋白质降解很重要，而且对于开启正常胚胎发育所需的蛋白质表达也可能至关重要。

https://www.frontiersin.org/journals/cell-and-developmental-biology/articles/10.3389/fcell.2024.1474009/full

概述：江博文-22级硕士 指导：张鲁 副教授