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小分子诱导的靶向蛋白质降解是新药发现和开发中一种极具前景的方法。神经退行性病变、肿瘤发生、适应性免疫等生理病理过程均与蛋白激酶DYRK1A和DYRK1B密切相关。亚利桑那大学研究团队通过将ATP竞争性DYRK1抑制剂与E3连接酶配体CRBN结合以诱导DYRK1A和DYRK1B的泛素化和降解，首次开发出了一种新型DYRK1蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）。其中，化合物DYR684在细胞水平能够快速、高效、选择性地降解DYRK1A，DYRK1B无酶促活性的剪接变体（p65）则抵抗降解。与竞争性激酶抑制相比，DYR684对DYRK1的靶向降解作用更好地抑制了下游信号，表明DYRKs是PROTAC开发的可行靶点，DYR684有望成为DYRK1A和DYRK1B的特异性化学探针。药渡CyberSAR系统提供了对DYRK1抑制剂分子的深入解析。系统通过聚类结构视图和原始结构视图，展示了与靶点相关的活性分子，并以研发阶段时光轴的形式呈现了潜力Hit。此外，CyberSAR还提供了适应症和试验设计的可视化分析，帮助研发人员快速获取靶向结构信息，开拓研究思路。尽管CyberSAR在本案例分子的初步开发中未被使用，但其在解析和优化药物分子方面显示出巨大的应用潜力。![]()
双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A（DYRK1A）是一种高度保守的蛋白激酶，在人体组织中广泛表达，是细胞增殖和分化的主要调节因子，与神经退行性改变、肿瘤进展、炎症、糖尿病、心肌梗死、病毒感染等多种疾病密切相关。DYRK1B的催化域与DYRK1A具有85%的序列同源性，但在细胞表达类型上更为有限，被视为潜在的癌症药物靶点。DYRK1A和DYRK1B（统称为DYRK1）在疾病中的过度活跃促使了DYRK1抑制剂的开发，这些抑制剂多为经典的1型激酶抑制剂，通过占据ATP结合位点来干扰酶活性，且难以对DYRK1A和DYRK1B进行区分。分子诱导的靶向蛋白质降解是是新药发现和开发中一种极具前景的方法，PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）作为异双功能分子通过募集E3泛素连接酶来诱导目标蛋白的泛素化和降解。然而，DYRK1A对多种降解剂存在抗性。除DYRK PROTACs外，DYRK1A也可被CaNDY和DYR219通过其他机制降解，但这需要长时间的孵育和较高的药物浓度，这在一定程度上限制了CaNDY和DYR219作为化学探针的使用。本研究通过将ATP竞争性DYRK1抑制剂与E3连接酶配体CRBN结合，首次开发出了DYRK1 PROTAC。其中，化合物DYR684以蛋白酶体依赖性方式诱导了DYRK1A和DYRK1B的有效降解，较传统激酶抑制剂具有更强的DYRK1抑制活性。
DYR530是在对DYR219进行构效关系研究后开发出的高亲和力DYRK1A抑制剂，较DYR219有更好的选择性和药代动力学性质。研究人员通过解析DYRK1A与DYR530的共晶结构确定了连接子附着位点。DYR530与ATP位点的结合符合I型激酶抑制剂特征。DYR530的2-氨基吡啶和咪唑并吡啶环深入ATP结合口袋并与铰链区中的Lys188、Glu203、Asp307、Leu241形成氢键，2-氨基吡啶与Val306、Phe238形成范德华相互作用，咪唑并吡啶环与Phe238、Leu294、Leu241、Met240、Ala186形成范德华相互作用。N-甲基哌嗪与蛋白质接触较少且朝向溶剂区，是理想的连接子附着位点。![]()
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研究人员将不同长度的PEG连接子连接到DYR530的哌嗪部分，再分别与VHL配体1或CRBN配体泊马度胺相连，得到了DYR617-619、DYR625和DYR622-624。在HEK293细胞中评价这些化合物对DYRK1A和DYRK1B的降解能力，结果表明基于CRBN的PROTAC能显著降低细胞中的DYRK1A水平，而靶向VHL的分子不能有效降解DYRK1A。延长CRBN PROTAC的连接子长度可促进DYRK1的降解，如以4-PEG为连接子的PROTAC（DYR624 - 60% Dmax DYRK1A）的降解作用优于以2-PEG为连接子的PROTAC（DYR622 - 40% Dmax DYRK1A）。![]()
接着，研究人员继续对连接子和CRBN配体部分进行了结构优化。将聚乙二醇胺、哌嗪、氮杂环丁烷与沙利度胺的3位偶联，得到了DYR665、DYR696和DYR697；引入CRBN E3连接酶调节剂CC-220（伊伯多胺）得到了DYR662、DYR666、DYR661和DYR660；引入高亲和力CRBN配体5-氨基硫胺100得到了DYR667、DYR684和DYR685。活性评价结果显示，部分化合物的DYRK1A降解能力显著提高，同时它们对DYRK1B也具有一定的降解作用。其中，DYR684的活性最佳，说明吡啶-哌啶可能为活性必须结构。![]()
对DYRK1A/DYR684/CRBN三元复合物结构的模拟结果显示，DYR684跨越了DYRK1A ATP口袋和CRBN沙利度胺结合位点，形成了多重蛋白-蛋白相互作用、盐桥相互作用以及氢键相互作用，这与DYR684的功效和选择性密切相关。对DYR684的激酶组选择性进行分析发现，它命中的激酶数量比DYR530更少。这一结果与先前的研究结论相符，即添加连接子和E3招募配体部分可显著减少与1型激酶抑制剂结合的靶激酶数量。![]()
通过对戊二酰亚胺上的氮原子进行甲基化得到DYR813。DYRK1降解曲线显示，DYR813在较高浓度下会使DYRK1A水平适度降低，而在较低浓度（100nM）下，DYR813不影响DYRK1A水平，说明DYR684的DYRK1A降解活性与CRBN招募相关。![]()
用DYR684处理HEK293细胞24小时发现，DYR684以浓度依赖的方式降低了DYRK1A和DYRK1B的水平，对DYRK1A的DC50值为12.3nM，对DYRK1A的最大降解百分比约为90%，对DYRK1B的最大降解百分比约为50%。传统的1型抑制剂DYR530、L41或CaNDY均无法有效降低DYRK1水平。此外，DYR684不改变衔接蛋白DCAF7的水平。DYR684在高浓度下效力的降低可归因于“钩状效应”，这是依赖三元复合物形成的异双功能配体的典型特征。![]()
用100nM的DYR684处理HEK293细胞，8小时内HEK293细胞中的DYRK1A和DYRK1B几乎达到最大降解程度，随后DYRK1B再次出现，而DYR684对DYRK1A的影响持续了至少48小时，但DYRK1B水平的恢复与基因表达增加无关。最后，研究人员对洗脱后DYR684介导的降解持续时间进行评估发现，洗脱后的48小时内，DYRK1A水平并未恢复，表明DYR684在这些条件下具有持续降解DYRK1A的作用。![]()
DYRK1B剪接变体p65对DYR684诱导的降解具有抗性
在图7和图8中，DYRK1B存在代表p69和p65的双条带，残留的DYRK1B信号主要由迁移更快的p65变体引起，进一步的实验证实了p69变体的选择性减少。DYRK1B-p65在激酶结构域内缺少40个氨基酸，是一种无催化活性的假激酶，对PROTAC存在潜在的抗性。通过生成稳定过表达的带有HiBiT标签的DYRK1B-p65的HEK293细胞系进行分析发现，用1μM DYR684处理后，DYRK1A丰度降低较DYRK1B-p69更为显著，而DYRK1B-p65则对降解完全抵抗，这可能是因为PROTAC不能与变化的催化结构域结合。![]()
DYR684通过CRBN介导的泛素化诱导DYRK1蛋白酶体降解
研究发现，用过量L41或来那度胺预处理HEK293细胞可阻止内源性DYRK1A/B的降解，说明CRBN结合对于DYR684的降解作用而言是必需的。用NEDD8激活酶（NAE）抑制剂MLN4924进行预处理也减弱了DYRK1A/B的降解，这表明DYR684的降解作用涉及泛素连接酶CRL。用p97解折叠酶抑制剂处理可抑制DYRK1A/B的降解，说明p97解折叠对蛋白激酶的降解至关重要。用蛋白酶体抑制剂硼替佐米进行处理证实了DYRK1A/B的降解取决于蛋白酶体活性。过表达实验验证了泛素与DYRK1A的结合。总之，上述结果表明，DYR684招募E3连接酶配体CRBN以诱导DYRK1A/B泛素化，继而发生p97介导的解折叠和蛋白酶体降解。![]()
降解的连续步骤共同影响了PROTAC诱导的靶标降解动力学。为对DYRK1的降解进行实时表征，研究人员对稳定表达GFP-DYRK1A或GFP-DYRK1B融合蛋白的HEK293细胞进行DYR684或非降解类似物DYR813处理，连续6小时监测GFP荧光。结果显示，GFP-DYRK1A被快速有效地降解，初始降解速率约为0.74h⁻¹（t1/2=57min），GFP荧光最大降低98%。GFP-DYRK1B以1.16h⁻¹的速率降解（t1/2=36min），在降解到86%时达到平台期。1μM DYR684对过表达的DYRK1A和DYRK1B的快速降解表明，当内源性DYRK1被100nM的DYR684降解时，蛋白酶体降解所涉及的各个机制步骤都没有饱和，所以这种处理不太可能对细胞蛋白质质量控制系统产生负面影响。![]()
DYRK1A和DYRK1B是癌症治疗的潜在药物靶点。用DYR684处理不同人类癌细胞系8小时，结果显示DYR684具有细胞系特异性作用，在SH-SY5Y神经母细胞瘤和A549肺腺癌细胞中，DYRK1A发生完全或实质性降解；在PANC-1胰腺癌细胞中，DYRK1A部分降解；HeLa宫颈癌细胞和OVCAR3卵巢癌细胞对DYR684存在抗性。用DYR684处理SH-SY5Y和A549细胞24小时观察到DYRK1A和DYRK1B的持续耗竭。![]()
为评估DYR684对DYRK1A/B下游靶点的影响，研究人员对SF3B1的磷酸化情况进行了评估。10nM的DYR684可近乎最大程度地抑制SF3B1磷酸化，SF3B1磷酸化的降低可能是由于DYRK1的活性被直接抑制或是由于PROTAC诱导的降解作用。通过比较DYR684与非降解对照物DYR813的效果发现，DYR813能部分抑制SF3B1磷酸化，表明其能结合DYRK1并阻断ATP结合位点，同时也说明在100nM浓度下DYRK1未被完全占据，说明对于通过“事件驱动”机制起作用的药物，最大程度的靶点结合并非是高效性的必要条件。![]()
为探索DYR684在蛋白质组水平的降解选择性，研究人员进行了无偏倚的定量全局蛋白质组学分析。在HEK293或SH-SY5Y细胞中用100nM的DYR684或溶剂处理24小时后，对6500余种蛋白质进行定量，发现DYRK1A是唯一显著降解的蛋白激酶。在HEK293细胞中未检测到DYRK1B。与Western blot结果一致，DCAF7水平不受DYR684的影响。极少数的蛋白质在处理后表现出显著变化。![]()
DYR684在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的细胞毒性作用
由于DYRK1A和DYRK1B是癌症治疗的药物靶点，研究人员对DYR684在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的作用进行了研究。结果显示，用2μM顺铂、100nM DYR684或两者同时处理细胞会导致中等程度细胞毒性，肉眼观察可发现联合处理的细胞死亡明显增加，表明DYR684降低了神经母细胞瘤细胞的活力，且能与顺铂联合使用。![]()
DYR684在生物相关缓冲液中的溶解度较低，但远高于DC50值。DYR684在肝微粒体和全血中稳定性好。DYR684与蛋白质高度结合，PAMPA数据表明其难以通过血脑屏障。动力学分析显示，DYR684驻留时间长、解离慢。小鼠体内药代动力学参数显示，DYR684腹腔注射后快速吸收，血浆浓度能够在一定时间内维持在DC50值以上，可实现对DYRK1的最大降解。DYR684的高血浆蛋白结合导致其清除率相对较低。目前尚未对DYR684进行体内代谢物鉴定。推测泊马度胺结构可能是导致其血浆不稳定性的因素，将邻苯二甲酰亚胺-戊二酰亚胺换为苯基戊二酰亚胺可增加血浆稳定性。Xenosite软件预测N-脱烷基化和葡萄糖醛酸化可能是DYR684的主要代谢途径。![]()
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本研究基于DYRK1抑制剂DYR530开发出了CRBN招募降解剂DYR684，首次证实了DYRK激酶可被PROTAC降解。DYR684在物理化学和药代动力学特性、效力、靶标选择性、机制验证和非降解对照化合物的可用性方面符合化学探针的关键标准。与传统的1型抑制剂相比，DYR684能持续有效地降低DYRK1A信号，对DYRK1B的不同剪接变体有不同作用。目前，对DYR684的进一步的优化仍在进行，旨在改善药代动力学性质和选择性，以推动DYRK1降解剂的临床转化。10.1021/acs.jmedchem.4c01130
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1.药渡CyberSAR结合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性的结构，通过CyberSAR以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就本文靶点之一DYRK1A举例如下：
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2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于靶点相关实验测试活性的分子以“母核结构聚类”的形式展示。其中“绿色字体高亮的”为文献报道的体外酶、细胞活性测试实验中IC50<1000nM的活性分子结构、具体实验、实验结果及实验来源。
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3.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“原始结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献具有关于靶点相关实验测试活性的分子以“研发阶段时光轴”的形式展示。其中绿色高亮展示了潜力Hit。
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4.在靶点界面选中“适应症”选项标签，可以可视化直观分析现收集的各类大数据。
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