病原真菌是全球农业可持续发展面临的主要威胁之一。2022年，联合国粮农组织（FAO）报告称，全球有168种作物受到了数百种真菌病害的影响。黄萎病菌（Verticillium dahliae）是一种土壤传播的半活体营养型丝状真菌，通过根部感染并在植物的维管系统中定殖，导致寄主植物出现萎蔫症状，尤其是对棉花等作物造成严重的黄萎病，极大地影响了作物的产量和质量。由于化学杀菌剂难以有效控制黄萎病的危害，培育抗病品种被认为是经济上可行且最有效的解决方案。已知病原菌会通过产生大量效应因子来抑制植物的免疫防御或直接产生毒素诱导细胞死亡，以促进感染过程。因此，发现黄萎病菌的关键效应蛋白，并基于这些蛋白与宿主的互作关系进行靶标鉴定及育种应用，是提高作物抗病性的重要策略。
近日，南京农业大学棉花遗传与种质创新利用团队在国际著名学术期刊Nature Communications在线发表了题为“Re-localization of a repeat-containing fungal effector by apoplastic protein Chitinase-like 1 blocks its toxicity”的研究论文。该研究首次鉴定了一种具有独特串联重复结构域的新型真菌毒性蛋白VdTRP，并揭示了其致病机制；同时，解析了棉花中的一种细胞壁关键蛋白——类几丁质酶CTL1，是如何在质外体与VdTRP相互作用，阻止VdTRP靶向细胞膜诱导细胞死亡的抗病机制；研究还提出了基于病菌毒性蛋白的宿主互作靶标关键基因挖掘及育种利用策略。
为了促进寄主植物的定殖和感染，病原真菌会释放大量的效应因子来调节宿主的生理状态或避免被宿主细胞识别。与细菌效应因子通过III型分泌系统注入植物细胞不同，真菌效应因子既能在质外体也能进入植物细胞内部发挥作用。据估计，引起作物黄萎病的大丽轮枝菌能够编码超过700种分泌型效应蛋白。尽管一些效应蛋白的功能已经得到描述，但大多数效应蛋白的具体功能仍不清楚。
在这项研究中，科学家们从海岛棉H7124诱导的黄萎病菌强致病株V991的转录组数据中鉴定到了一个新的毒素蛋白VdTRP，该蛋白在根组织中显著上调表达。VdTRP的结构包括信号肽序列、非典型真菌胞外膜蛋白（CFEM）结构域、由富含脯氨酸基序(IPGGCNPAHPGSCP)构成的四肽串联重复结构域以及C端基序。农杆菌介导的瞬时表达实验表明，VdTRP能迅速且强烈地导致烟草、棉花和拟南芥叶片细胞死亡。敲除了VdTRP的V991突变菌株对棉花的致病力显著下降。进一步的研究显示，类CFEM结构域和四肽重复结构域对于VdTRP的毒性至关重要。缺失类CFEM结构域会降低VdTRP对烟草细胞的毒性，而缺失富含脯氨酸的四肽重复结构域则会使VdTRP对烟草细胞的毒性完全消失。氨基酸突变分析证实脯氨酸在VdTRP的毒性作用中起着关键作用，而且富含脯氨酸基序的串联重复次数与细胞毒性程度之间存在显著关联。亚细胞定位实验表明，VdTRP定位于细胞膜，且类CFEM结构域对其细胞膜定位至关重要。体外脂质结合实验表明，VdTRP的类CFEM结构域能够与细胞膜成分磷脂酰丝氨酸（PS）结合。进一步的实验发现，纯化的VdTRP蛋白能够引起体外培养的大鼠心肌细胞H9c2的死亡。使用扫描离子电导显微镜（SICM）观察到，VdTRP导致H9c2细胞表面形成孔洞，引发离子泄漏。这些实验结果表明，VdTRP通过类CFEM结构域与PS结合定位到细胞膜上，然后通过富含脯氨酸的四肽重复结构域发挥毒性作用，导致细胞膜穿孔、离子泄漏和最终的细胞死亡。
为了寻找棉花中能够抵抗VdTRP毒性的靶标，研究人员采用酵母双杂交筛选和其他蛋白质互作技术，证明了VdTRP与棉花中的类几丁质酶CTL1在体内外均能相互作用。酵母双杂交片段实验、GST pull-down实验和微量热泳动分子互作实验表明，CTL1主要与VdTRP的C端基序相互作用。当在烟草中共同表达CTL1和VdTRP时，VdTRP的定位从细胞膜转移到了质外体，并且VdTRP诱导的细胞死亡程度有所减轻。相反，如果共表达的是缺失了C端基序的VdTRP△C-terminal，VdTRP△C-terminal的细胞膜定位不变，且对细胞的毒性也没有明显减弱。这些结果表明，CTL1可以在质外体与VdTRP的C端基序相互作用，阻止VdTRP靶向细胞膜诱导细胞死亡，从而增强植物的抗病性。
研究还发现，CTL1并不具备几丁质酶活性，对大丽轮枝菌也没有抗菌效果。转基因实验显示，在陆地棉中超量表达CTL1可以显著增加植株内的糖代谢水平，提高内源水杨酸含量，并减轻VdTRP对棉花的毒性，大幅提升了棉花对黄萎病的抵抗力。然而，当使用RNAi干扰CTL1的表达时，转基因棉花表现出严重的生长发育障碍，无法完成生命周期。利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术沉默CTL1后，观察到棉花植株出现了细胞壁缺陷、茎干脆弱和根系发育不良的现象。这表明CTL1是棉花正常生长发育所必需的基因。
总结来说，这项研究阐明了棉花生长发育关键因子类几丁质酶CTL1参与黄萎病抗性的分子机制。CTL1通过在质外体与黄萎病菌的新型毒性蛋白VdTRP相互作用，阻止VdTRP定位到细胞膜上，减少了其对植物细胞膜的毒性；超量表达CTL1还能增强植株内的糖代谢，上调植物细胞受体蛋白/激酶类基因的表达，促进水杨酸（SA）的合成并激活植物的免疫反应。这些发现为培育抗病棉花新品种提供了理论基础和基因资源。
质外体蛋白CTL1阻止新型毒蛋白VdTRP破坏细胞膜，诱导植株提高免疫，增强棉花对黄萎病抗性的工作模式图
此外，研究者利用VdTRP中富含脯氨酸的重复基序IPGGCNPAHPGSCP作为探针，在公共数据库中搜索了不同类型的真菌基因组序列，发现该基序在盘菌亚门下的多个纲中253种真菌中保守存在，重复次数从1到15不等。选取了三种不同来源的效应蛋白进行了毒性测试，发现它们均能引起不同程度的植物叶片萎蔫。其中，灰葡萄孢菌的XP-001561412蛋白与VdTRP结构相似，含有信号肽、GPI膜锚定结构域和富含脯氨酸的重复基序，显示出较强的毒性，对烟草细胞造成严重坏死。这些结果表明富含脯氨酸的重复基序在多种病原真菌效应蛋白中具有相似的毒性作用，而含有膜结合结构域的效应蛋白通常具有更高的毒性。
许多细菌、真菌和卵菌在感染植物的过程中会分泌一类能够引发细胞凋亡的蛋白毒素，这类毒素蛋白的发现及其作用机制正受到越来越多的关注。先前的研究中，团队已经鉴定出过氧化物酶体定位的溶血磷脂酶GhLPL2，它可以抑制黄萎病菌毒素蛋白VdNLP1的毒性作用（Wang et al., 2023, The Plant Journal）。本次研究又鉴定了一个具有独特串联重复结构域的黄萎病菌新型毒性蛋白，并进一步解析了棉花类几丁质酶CTL1如何作为靶标阻止病菌毒素蛋白的侵袭。GhLPL2和CTL1都是棉花生长发育所必需的基因。这两项研究的结果表明，通过调控必需基因的表达，植物可以抵御蛋白毒素类效应因子对细胞的毒性，显著提高黄萎病的抗病性。这是一种区别于模式触发免疫（PTI）和效应触发免疫（ETI）的提高作物抗病性的新策略。
实验室博士研究生柳汉桥为论文第一作者，郭旺珍教授和南京农业大学生命科学学院王心宇教授为论文共同通讯作者。已毕业硕士研究生张文姝参与了VdTRP敲除与恢复突变体创制与鉴定工作，已毕业博士研究生何庆飞、硕士研究生热衣拉·艾克木和许慧娟参与了转基因棉花创制工作。在读博士研究生郭展、王璐，钟山青年研究员李维希博士和王桂林博士也参与了部分研究工作。南京医科大学陈峰副教授和博士研究生宋瑶在SICM实验中提供了大量帮助。南京农业大学植保学院王燕教授和窦道龙教授，实验室李珊教授和张群教授，动物医学院郭大伟教授在本研究完善过程中提供了建议和帮助。该研究得到农业生物育种国家科技重大专项、江苏省重点研发计划和江苏现代作物生产协同创新中心等项目资助。
