点击箭头处“体外诊断IVD知识库”，关注我们哦！！
你有没有遇到这样的事情，你活化后微球还是五彩斑斓，但是当你加完抗体，反应一两小时后，五彩斑斓的微球变得暗淡无光！是什么原因呢，小白的你请认真看完！可能原因和解决方法如下，如有不对地方多多指教！
1、抗体加入量不足
微球与抗体之间存在着特定的相互作用机制。当加入的抗体量过低时，就会出现一种竞争现象。微球在溶液体系中数量众多，它们具有与抗体结合的活性位点。而此时，由于抗体数量过少，过量的微球就会去竞争这少量的抗体。这种竞争并非简单的争抢，而是涉及到微球表面化学结构与抗体分子结构之间的相互识别与结合的竞争。微球表面的特定结构会与抗体的抗原结合位点有一定的亲和力，当众多微球竞争少量抗体时，就可能导致微球之间相互靠近。这种靠近会进一步引发微球的团聚。这种情况下，建议适当增加抗体用量。但增加抗体用量也并非随意为之，需要根据具体的微球类型、实验体系以及预期的标记效果等因素进行精确的调整。并且过多的抗体也会导致聚沉，背景信号高的。
2、缓冲液pH值不合适
抗体具有复杂结构的生物大分子，其等电点是一个重要的化学性质。等电点是指在某一pH值下，抗体分子所带的正电荷和负电荷数量相等，此时分子的净电荷为零。当缓冲液pH值接近抗体等电点时，微球表面的电荷与溶液中离子的相互作用会失衡。这种失衡可能导致微球之间的静电斥力减小，从而使得微球更容易发生团聚。一般的PH值为6.8-7.5之间。这里特别要注意标记过程中，离子浓度的影响，这个影响不能忽视，一般在没有离子或弱离子的缓冲液也下反应比较好！
3、加入EDC后微球发生团聚
EDC在微球活化中起到了促进微球表面化学基团与抗体之间共价键形成的作用。然而，EDC的加入量多少也会导致微球发生团聚。当加入EDC后微球发生团聚首先考虑的是活化剂过量。EDC过量时，一方面，过量的EDC可能会与微球表面过多的化学基团发生反应，导致微球表面的化学结构发生改变。这种改变可能使得微球表面原本的电荷分布或者亲疏水性发生变化，从而影响微球在溶液中的稳定性。另一方面，过量的EDC可能会与溶液中的其他成分发生不必要的副反应，产生一些杂质或者改变溶液的化学环境，进而影响微球的分散状态。另外，可以在加入EDC之前先加入适量的Sulfo - NHS（N - 羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐）。Sulfo - NHS在这个过程中起到了稳定反应中间体的作用，有助于提高反应的选择性和效率。
4、微球表面电荷的影响
微球在制备和储存过程中，其表面会吸附一些表面活性剂，这些表面活性剂有助于维持微球在溶液中的分散状态。然而，当去除表面活性剂之后，微球的稳定性就会受到其自身表面性质的考验。微球表面的亲疏水性存在差异，这会影响微球与周围水分子以及其他溶质分子的相互作用。而微球所带的电荷更是影响其稳定性的关键因素。在溶液中，微球所带电荷会产生静电斥力，防止它们聚一起。但是，当微球表面的亲疏水性及所带的电荷等存在差异，这样的情况下微球在去除表面活性剂之后，由于表面所带电荷的排斥力不足以维持在体系中的稳定性而发生聚集甚至沉淀的现象。遇到该种情况时使用者可以重新加入少量的表面活性剂（如0.025%SDS（十二烷基硫酸钠））。重新加入表面活性剂可以在一定程度上恢复微球表面的稳定性，通过调整微球与周围环境的相互作用，使得微球重新获得分散性。
5、离心力过大
离心法是利用离心机产生的离心力，使微球在离心管中根据其密度与周围溶液的差异而沉降到离心管底部或者形成分层。然而，不同粒径大小的微球所需要的离心力不一样。这是因为微球的粒径大小直接影响其在离心力场中的沉降速度。粒径较大的微球在相同的离心力下会比粒径小的微球沉降得更快。当离心力过大时微球紧贴在离心管底部，相对来说重悬就比较困难。这是由于过大的离心力使得微球被紧紧地压在一起，形成了较为致密的结构。这种致密结构会破坏微球之间原本的松散状态，使得微球之间的相互作用力增强。在重悬过程中，就需要克服这些增强的相互作用力。这种情况下需要适当的降低离心转速或减少离心时间使微球尽可能的以一种松散的团状结构形式存在。降低离心转速或者减少离心时间需要根据微球的具体粒径、密度以及溶液的性质等因素进行调整。
6、微球黏壁现象
在微球离心分离后，微球黏壁现象是经常会遇到的一个问题。一方面，离心过程中微球与离心管壁之间存在着静电作用或者范德华力等相互作用。另一方面，离心管的材质也会对微球黏壁现象产生影响。当出现这种现象时可以从以下两个方面进行解决，第一是加大离心力。加大离心力可以使微球更加紧密地聚集在离心管底部，减少微球与离心管壁的接触面积，从而降低微球黏壁的可能性。但加大离心力也需要谨慎操作，因为过大的离心力可能会对微球的结构和性能产生不良影响，如前所述的导致微球团聚等问题。第二是使用进口低吸附材质的容器。进口低吸附材质的容器通常经过特殊的表面处理，其表面具有较低的表面能，微球与这种容器壁之间的相互作用较弱，从而可以有效减少微球黏壁现象。
7、超声处理
在重悬微球的过程中可以先用移液器用力吹打微球使之初步重悬后，再采用超声的方式进一步使微球彻底分散（如水浴超声，大功率，建议不低于500W，时间不低于1 - 3min）。先用移液器用力吹打微球是一种较为温和的初步重悬方法。移液器吹打可以使微球在溶液中形成一定的流动，打破微球之间的部分聚集状态。超声处理是利用超声波在溶液中的空化效应。当超声波在溶液中传播时，会产生一系列的疏密相间的压力波，这些压力波会在溶液中形成微小的气泡，在形成和破裂的过程中会产生强烈的冲击力和剪切力，可以有效地破坏微球之间的聚集结构，使微球彻底分散。
综上所述，微球加完抗体后发生聚沉可能是由于多种因素造成的。这些因素涉及到抗体的加入量、缓冲液的性质、活化剂的使用、微球表面性质、离心操作以及重悬方法等多个方面。通过上述方法，可以有效地解决微球聚沉的问题！
今天就介绍在这里，文章中的内容仅供参考，如果对您有所帮助还望点赞、转发+关注，我们下期不见不散！
要了解更多体外诊断研发技术、付费内容、配方、注册资料、行业报告、性能评估模板等，欢迎扫下面二维码加入“体外诊断IVD知识库-知识星球”进行免费咨询、不限次数提问和星友们一起成长吧！
推 荐 阅 读
2.这三条曲线 “校准曲线、标准曲线、工作曲线 ”什么区别 ？
在这里每天
更新最关键的知识点
更多精彩内容
请扫描二维码
