反向育种要是做成了，种子行业会不会乱套？

创业 2024-11-18 20:31 上海

编辑：智种网

来源：Dominance

按：反向育种（Reverse Breeding，RB）是一种新的育种技术，利用反向育种可以从任何杂种材料中分离得到纯合亲本。这种技术4,5年前还有很多文章讨论，现在好像基本没人提起了。通过抑制减数分裂重组，反向育种可以完美的获得互补的亲本纯系，重构初始杂种的基因组成。通过在中选的优良杂种中利用基因工程手段消除染色体交叉重组，可获得无重组的雌雄配子体，这些配子体组织培养或自发加倍形成双单倍体（DHs），从中选择互补的亲本纯系，即可永久的重塑初始的杂种基因组合。本文从反向育种的流程，理论基础，技术基础以及未来的发展应用等方面，对反向育种进行了全面的介绍。

杂种优势是一种普遍存在，并在动植物中得到广泛应用的遗传学现象，具体是指两个遗传结构不同的品系（strains）、种系（races）或物种（species）其杂种F1代在生长势，生活力，适应性，产量等方面明显优于双亲或者超过双亲的现象。近年来对于杂种优势的遗传机理虽然有所阐述但其分子机理仍然不明(Chen 2013)。杂种优势机理的不明使得育种家们面临这样一个问题：在不知什么样的杂交组合会产生最优表现的情况下，对作物进行品种改良。

因为杂交种不能自交留种，育种家必须通过优良的自交系亲本杂交来生产杂交种，通过改良亲本自交系来提高杂种优势。由于亲本自交系的选育和改良必须先于杂交种的生产，使得这一过程耗时费力。由于减数分裂基因重组，育种家很难从基因组成未知但表现优秀的杂合材料中，直接分离出可以重现该杂合材料优良表型的自交系。因此，能否直接从优良的杂合材料中分离出可用于重现其基因组合的自交系，成为育种家利用各种杂交群体或分离群体中优良杂合子的关键。组织培养或无融合生殖(van Dijk and van Damme 2000)虽然可以实现杂合种的保留，但由于没有亲本自交系，限制了其后杂交种的改良。Dirks 等在2003年提出，可以通过构建互补的纯合系来固定优良的杂合基因组合，这一设想主要通过干扰减数分裂同源重组的形成，在后代配子中寻找能够重现杂合材料基因组合的单倍体材料，经过加倍培养为双单倍体（DHs）而实现。由于没有重组的发生，互补的亲本DHs杂交可以重现优良杂合材料的基因组成，从而实现杂种优势的固定和利用。这一方法实现了从未知优良杂交种中直接生成亲本自交系的设想，由于其与传统育种相反的策略所以被命名为反向育种（reverse breeding），通过该方法获得的亲本自交系，可作为遗传改良的基础材料，培育新的杂交品种。

反向育种

反向育种最早由荷兰一个公司提出并申请两项专利（Reverse Breeding, WO/03/017753,2001;Near Reverse Breeding, WO/2006/094773,2005），直到2012年才在拟南芥中首次验证成功(Wijnker, van Dun et al. 2012)。反向育种主要包括以下两步：1 抑制杂合材料中的交叉重组；2 包含非重组染色体的小孢子重新分化加倍成DHs(Dirks, van Dun et al. 2009)。图1显示了反向育种（RB）基本流程：在分离群体中（本例中是一个F2分离群体），有一个基因型未知但表现型优良的植株被选择出来，通过转基因或化学手段抑制其染色体重组交叉，收集无交叉形成的配子，通过小孢子培养，无性生殖等培样并进一步诱导加倍形成双单倍体（DHs）植株。从这些DHs中即可选择出能够重构杂合体基因型的亲本纯系组合。

RB的另一个重要用途是染色体替换系（chromosomesubstitution lines，CSLs）的构建，染色体替换系是近等基因系的特殊情况，在CSLs中供体亲本的整条染色体渗入到轮回亲本遗传背景中。通过传统回交的方法，很难有效的构建包含目标染色体的CSLs (Koumproglou, Wilkes et al. 2002)，而通过反向育种，我们可以构建所有可能的染色体替换系(Wijnker, Deurhof et al. 2014)。理论上，反向育种可以将两个差异亲本的染色体以任何可能的方式进行重新排列。图3 向我们展示了染色体替换系的构建过程，CSLs的方便构建，为我们基因定位，上位性分析，NILs(Keurentjes, Bentsink et al. 2007)和HIFs（targeted generation of heterogeneous inbred families）(Tuinstra, Ejeta et al. 1997)的建立提供了便利。

图1 反向育种应用示意图

两个纯合的亲本材料杂交产生杂合F1代。F1自交形成分离的F2群体。在在分离群体中，一株表现优良但遗传组成未知的杂合株被选为起始材料用于之后的反向育种（灰色部分）。通过抑制减数分裂重组交叉，同源染色体没有发生重组而直接进入单倍体配子中。注意，在本例中，杂种材料中4条染色体可以在配子体中形成16种不同的组合-为了显示方便只展示出其中5种。利用离体培养或自然加倍的方法，将这种无交叉的配子体培育为双单倍体（DHs）。从这些双单倍体中即可以选择出互补的亲本，相互杂交重现起始杂合材料基因组成。

图2 野生型（上）和RNAi:DMC1转基因材料中，染色体在减数分裂过程中的形态比较

图3 反向育种构建染色体替换系

两个纯合的亲本杂交产生F1代，应用反向育种培养DHs群体。注意，在这些DHs群体中，两个亲本中的染色体发生了互换。最下左：某一亲本背景下单对染色体杂合的材料的创建；最下右：杂合背景下单对染色体为纯合的材料的创建。

反向育种的理论基础

减数分裂交叉结的功能

减数分裂是有性生殖生物中高度保守的生物学过程，在减数分裂过程中，DNA复制一次，但却进行两次细胞分裂，这样就使得配子体中有孢子体一半的染色体，并通过受精作用加倍，保证了在世代交替过程中染色体数目的恒定。同源染色体配对，联会和同源重组是减数分裂前期I的重要事件，同源重组的进行使得同源染色体发生片段交换，从而增加了后代的遗传多样性。同源重组形成交叉，同源染色体紧密地结合在一起形成二价体。到双线期，联会复合体解体，同源染色体大部分位置分离，仅在交叉形成的地方以交叉结的形式连在一起（图4）。交叉结的存在保证了同源染色体能够正确地排列在赤道板上并准确地分向细胞两级。在大部分植物中，一对同源染色体一般存在1到2个交叉结。在很多突变体中，染色体由于重组的异常，交叉结不能正常形成，而产生单价体（无交叉的染色体Achiasmaticchromosomes），染色体随机分离。(Zickler and Kleckner 1999, Osman, Higgins et al.2011)由于没有交叉结，单价体随机分离，同源的染色体可能移向同一极而形成非整倍体（aneuploidy）小孢子（图2）。因而，这些无交叉结的植株一般都是高度不育的(Hartung, Wurz-Wildersinn et al. 2007)。单价体越多，形成的非整倍体花粉越多，不育越彻底。假设每个单价体移向每一端的几率相同，那么，拥有正常染色体组成的小孢子几率为½^x，其中x为该物种单倍染色体的数目。以拟南芥(2n =2x = 10)为例，每32个小孢子中有1个染色体数目正常。当X增大到12时，分离的染色体能够形成正常配子体的几率仅为1/4000。由于每种作物可育花粉粒的数目不同，因此具体到不同作物时，整倍体的产生又有所不同。例如矮牵牛有7对染色体，每个花药中大约有30000粒花粉粒(Kapoor, Kobayashi et al. 2002)，因此，其每个花药中整倍体小孢子的数目为235个，拟南芥每朵花平均有2800粒花粉(Noyes, Baker et al. 2007)，在染色体随机分离同时不考虑二价体形成的情况下，可获得88粒整倍体小孢子。

互补亲本材料的获得

在反向育种试验中，一个杂合的二倍体，最多可以获得2^x种不同类型染色体组合的DHs。两个DHs能够互补，杂交重现杂合基因组合的几率为2^x⁄(2^x)² = (½)^x，而它们杂交不能重建原始基因型的概率则为1-(½)^x= （2^x- 1）/2^x。n个DHs之间相互杂交可有n(n-1)⁄2种组合（这里将正反交结果作为同一种基因型看待）。因此，可以计算出在有n个DHs的前提下，没有一对能够互补的DH系的概率为：[(2^x-1)⁄2^x]^{n(n-1) ⁄2}。至少能够得到一对可以互补的DHs组合所需的DH单株数目，可通过公式[(2^x-1)⁄2^x]^{n(n-1) ⁄2} = 0.01 (P = 99%)算出。因此，至少能够获得一对可以互补的DHs组合所需的DH数目，取决于单倍染色体的数目，表1 列出了不同物种在不同概率水平能够重现原始基因组合所需的非重组DHs数目。ErikWijnker等利用拟南芥杂种F1代,通过反向育种技术获得了65个DHs，检测出21中可能的基因型（理论值 2⁵=32），其中6对互补的亲本可以重现F1代原始杂种基因型。之后从中选取三对互补的反向育种双单倍体成功重建了基因型与原始杂种相同的Col/Ler杂种。(Wijnker, van Dun et al. 2012)

表1 不同物种中，在不同概率水平下，重建原始杂合基因型所需非重组DHs数目

反向育种的技术基础

有效的重组抑制

反向育种的实现依赖于对减数分裂交叉重组的有效抑制。因此，那些能够调控重组或交叉形成但又能保持染色体完整的基因将会是反向育种的首选。比如，拟南芥中的Asy1和水稻中的Pair2基因为酵母中Hop1的同源基因。它们是染色体联会复合体侧向成分相关蛋白，是染色体联会和重组所必须的重要组成部分。拟南芥和水稻中该基因的突变将会导致染色体在中期以单价体的形式存在(Nonomura, Nakano et al. 2006,Sanchez-Moran, Osman et al. 2008)。最近研究表明，在一些能够形成单价体的突变体中（desynaptic1 [dsy1], meiotic prophase amonipeptidase1 [mpa1]）(Pradillo, Lopez et al. 2007)，染色体在前期可正常配对，这样就提高了同源单价体在中期I移向细胞两极的可能性。PARTING DANCERS (PTD)突变体不仅可以完成配对，在单价体中还有少量重组的二价体存在，使得其更有利于具有正常单倍体数目的配子体形成(Lu, Wijeratne et al. 2014)。可以产生单价体突变表型的基因还有dmc1，sds，(Stacey, Kuromori et al. 2006)，rad51和spo11等(Azumi, Liu et al. 2002, Pradillo, Lopez etal. 2012, Pradillo, Varas et al. 2014)。

图4 一对同源染色体上一个交叉的存在不会影响反向育种的应用

中期I，在一个染色体对上有单个交叉存在，但其他染色体仍以单价体的形式存在。由交叉连接的同源染色体被牵引到细胞的两极，其他单价体随机移向两极，本例中，其形成正常的二分体（末期I）。减数分裂接着进入中期II,姐妹染色单体分离，末期II，4个配子体形成。其中两个配子体包含重组染色体（上），另外的两个配子则包含非重组染色体（下）。包含非重组染色体的配子体即可用于反向育种。

可以通过RNA干扰（RNAi），小干扰RNA(SiRNA)，TALEN靶向基因敲除或者CRISPR技术敲除上述基因，抑制同源染色体重组交叉。另外，显性-抑制（dominant-negative）基因的引入也可以实现上述基因功能的缺失。人类中的重组蛋白DMC1可以形成一个八聚体环，但当其氨基末端缺失81个氨基酸时，DMC1不能与ssDNA和dsDNA结合，从而失去剪切活性，形成单价体(Kinebuchi,Kagawa et al. 2005)。相似的DMC1显性-抑制等位基因型在小鼠中也可通过抑制正常DMC1功能，引起同源重组的缺失而形成单价体(Bannister,Pezza et al. 2007)。在植物中，稳定的遗传转化相对比较困难，在某些物种根本难以实现。病毒介导的基因沉默（VIGS）可以有效地诱导植物内源基因转录后基因沉默（PTGS）。当在植物中注射含有目的基因RNA序列的病毒时，植物由于防御反应会生成相应SiRNA来降解病毒中外源RNA，同时降解植物内源目的基因的mRNA，从而沉默重组交叉形成相关基因(Baulcombe 2004)。在植物中也可以通过嫁接转移的方式传递沉默分子以沉默目的基因(Shaharuddin, Han et al. 2006)。可将需要沉默目的基因的植株嫁接到转基因的枕木上，沉默重组相关的基因。这样，在很多作物中仅需要少量的枕木即可实现反向育种。外源喷施 mirin ，可以抑制Mre11-Rad50-Nbs1 复合体的功能，Mre11-Rad50-Nbs1复合体与Com1 ⁄Sae2 ⁄CtIP协作移除DSB处的SPO11蛋白，切除5’ 端DNA以露出3’单链DNA。MRN功能的缺失，使得DSB异常，染色体不能正常的重组(Osman, Higgins et al. 2011)。利用外施抑制剂进行化学遗传筛选的方法，会极大地加速RB的大规模应用(Dupré, Boyer-Chatenet et al. 2008)。利用化学抑制重组和嫁接转移沉默分子等方法进行RB所培育的DHs没有外源基因的转入和无交叉染色体的表型，因此这些DHs可直接用于之后的育种生产和遗传改良。当然，即使是利用转基因抑制重组获得的DHs，也可能不含任何转基因成分。例如，在一个杂种材料中沉默基因以杂合状态存在，那么一半的小孢子中不会含有转基因成分，通过这些小孢子培养得到的DHs也不含任何转基因成分。利用抑制基因位于不同染色体上的转基因株系，可以获得一套完整的不含转基因成分的互补DHs(Wijnker and de Jong 2008)。

在反向育种的实践过程中，并不需要完全的交叉抑制。在RNAi过程中，由于目的基因的不完全沉默，往往会在某些同源染色体对上形成交叉(Wijnker, van Dun et al. 2012)。一对同源染色体上交叉的存在使得这对染色体能够正常的移向细胞的两极，与无交叉的单价体相比，获得含有正常单倍体数目的配子体的几率提高了一倍。一次交叉产生两条重组的染色单体，但是在这个二价体中还有一对无交叉的染色单体存在。这样，其余染色体随机分离后，其中一半含有完整染色体组成的小孢子可以用于之后的反向育种（图4）。总体来说，残余的交叉（假设二价体中只有一次交叉）提高了DHs中含有重组染色体的可能性，但还有一半小孢子包含无交叉的染色体。获得的DHs可通过位于染色体两端的分子标记进行筛选。

双单倍体（DHs）的获得

一般情况下无交叉的减数分裂孢子体可以通过孤雌生殖或小孢子和花药培养来获得双单倍体植株。小孢子培养的效率存在物种特异性(Wędzony, Forster et al. 2009)。通过无交叉的减数分裂获得的小孢子培养而来的DHs如图1所示：它们都包含一整套来自亲本的无重组染色体。因为只有含有至少一套亲本染色体的小孢子才能进行细胞分裂，胚发育知道植株再生成为DHs，因此整倍体小孢子的筛选是部分自主完成的。超倍体（染色体数目>2n）后代的筛选可以通过qRT-PCR或者流式细胞仪进行筛选剔除。值得一提的是，在拟南芥中，可以通过与GFP-tailswap转基因株系杂交来获得单倍体植株，进一步加倍培育DHs。这种方法是通过调控着丝粒特异的组蛋白CENH3，在cenh3纯合突变体中表达改造的CENH3蛋白（GFP-tailswap），几乎完全雄性不育，但如果种植得当，每株中可以得到几百粒纯合的种子。当其与正常材料杂交时，来自于GFP-tailswap的基因组全部丢失，因此，通过正交或反交组合，即可获得父本或母本基因型的单倍体后代(Ravi and Chan 2010)。CENH3蛋白在真核生物中广泛存在，因此这种获得单倍体材料的方法可以应用到大豆、棉花、生菜和番茄等双单倍体培养困难或还未成功的作物上。

利用分子标记对DHs或其他育种材料进行基因分型在现代植物育种中已得到了广泛地应用(Kumar, Gupta et al. 2009)。在反向育种中，可以利用分子标记检测染色体来源，重组是否发生。对于来源于完全没有重组的减数分裂的小孢子培养得到的DHs，每条染色体只需一个多态性的分子标记，用于检测染色体的来源即可。而那些有残余交叉存在染色体，一对位于染色体两端的标记，即可确认染色体重组与否。

反向育种在育种实践中的应用
重塑杂合的种质资源

对于那些育种资源缺乏的作物，反向育种可以加快品种的开发进程。通过反向育种，某些表现优良的杂种材料可以在其遗传组成未知的情况下，进行繁殖，改良（图1）。表1向我们展示了在不同置信区间内，重建起始杂合基因型所需双单倍体植株的数目。对于染色体数目较少的物种来说，反向育种可以方便高效的实现超级杂交种的快速固定。比如，在玉米中，仅需98个DH系即可获得一对互补的亲本材料，重塑原始超级杂交种基因组合（P = 99%）。

准确地在染色体水平进行品种改良
作物中许多重要性状都是由位于不同染色体上多个基因互作共同调控的，这些性状很难直接选育改良。图3展示了在已知亲本组合的情况下，如何利用反向育种进行染色体替换系的构建。利用这种方法，我们可以根据实际需要构建背景杂合，只有一对染色体纯合的替换系，也可构建背景纯合，只有一对同源染色体杂合的替换系。通过前者，我们可以研究被替换的染色体上的基因与背景基因的上位互作效应。只有一对染色体为杂合的替换系自交后代中，杂合染色体携带基因调控的形状分离。将携带一条替换染色体的后代连续自交（或与背景亲本连续回交），该条染色体上调控重要目的性状的基因由于重组以及之后的自由分离而重新组合。育种家可在这些后代中选择优良的材料，实现在单条染色体水平上对感兴趣的性状进行调整和改良。上述实例向我们展示了，通过反向育种，育种家可以全面调控作物中每条染色体的状态（纯合或杂合），还可以对每条染色体上基因的组合进行更为精细的调节。

反向育种与分子标记辅助选择

通过与快速有效的基因分型技术相结合，反向育种技术将会成为强有力的育种工具。毋庸置疑的是，高通量的基因分型加速了早期DHs群体互补亲本基因型的鉴定筛选。更为便利的是，可以利用反向育种得到的材料自交或回交构建各种杂合自交系（heterozygousinbred families ,HIFs）用以研究基因间的互作。这些HIFs群体，可用于构建染色体特异的遗传连锁图谱和基因的精细定位。

细胞质雄性不育的改良

细胞质雄性不育(CMS)在高等植物中广泛存在并在水稻，油菜等重要的粮食和经济作物的杂交种生产中得到广泛的应用。在这些CMS系统中，雄性不育系的存在成为反向育种利用的一大障碍。在雄性不育材料中，只能利用孤雌发育来得到所需的DHs，而不是常用的孤雄发育（例如：小孢子培养）。这样的话，来源未知的雄性不育杂种，通过孤雌发育进行反向育种，直接即可获得拥有不育胞质的保持系，用于杂交制种。孤雌生殖在芸薹属，玉米，甜菜，黄瓜，甜瓜，水稻，洋葱，向日葵和大麦中均有报道(Keller and Korzun 1996)。但是，在很多物种中，随着花药和小孢子培养技术的发展，孤雌生殖的改良和应用已经远远落后。而且，孤雌生殖的效率比较低，这也阻碍了其应用。为了能够利用反向育种改良CMS，我们可以利用不育系（A）与含有一个恢复基因的临保系（B）杂交，利用该可育的杂种材料进行反向育种。在水稻中，已经成功克隆了多个CMS系统的恢复基因（Boro II ,RF1A RF1B Lead Rice-type,RF2;Hong-Lian CMS,RF5）(Wang, Zou et al. 2006, Itabashi, Iwata et al. 2011, Hu, Wang et al. 2012)。这样，就可以将恢复基因和交叉抑制基因连接到同一个载体中，进行转基因，构建一个“双抑制”（CMS 和交叉重组）系统进行反向育种。

总结和展望

反向育种的应用，使得育种家可以从未知的杂交组合中直接分离出纯合亲本用于杂交制种或品种改良。除此之外，通过反向育种结合自交或与亲本的回交，育种家可以在单条染色体水平上对材料进行靶向改良。同时，构建的染色体替换系还可以用于研究基因互作，图谱构建，精细定位等。

对于反向育种的研究，在拟南芥中实验验证完成之前(Wijnker, van Dun et al. 2012)，大部分研究主要是讨论其理论的可行性与应用的价值。拟南芥中反向育种的完成，标志着这项技术可以按照理论设想完成并应用于作物的遗传改良中。因为，调控染色体重组的基因在物种中比较保守，单倍体培养的技术在大部分作物中均已成为常规育种技术，这为反向育种未来的应用奠定了基础。尽管随着物种染色体数目的增多，染色体随机分离而获得正常单倍体数目小孢子的几率也随之下降，但大部分农作物单倍体染色体数目都小于或等于12，易于通过小孢子培养等技术获得互补的纯系亲本。可以应用反向育种的农作物有：黄瓜，洋葱，甘蓝，花菜，甜菜，玉米，豌豆，高粱，西瓜，辣椒，番茄，水稻，茄子等。在染色体数目较多（例如，大豆）的物种或多倍体物种（诸如油菜，棉花，小麦和马铃薯等）很难利用反向育种技术。

最近，新的育种技术层出不穷，锌指核酸酶 (ZFN)技术，CRISPR技术，寡核苷酸介导的诱变技术(ODM)，内源和外源（cisgenesisand intragenesis）基因转化，RNA介导的DNA甲基化 (RdDM)，在GM修饰的枕木上的嫁接技术，反向育种和农杆菌侵染等(Lusser and Davies 2013)，这些技术的应用极大地加速了育种的进程，与其他技术相比，反向育种所得材料不含转基因成分，可直接用于作物杂种优势利用和品种改良。

近年来，越来越多的研究试图通过改造减数分裂过程以增加遗传多样性（增加重组交换）或加快育种进程（阻碍同源重组）(Wijnker and de Jong 2008)。但是，通过增加遗传重组的频率以促进基因渗入改良亲本材料的方法仅仅是传统育种中亲本改良的延伸。传统的育种主要靠育种家观察选择，不难想象，对（超显性）复杂性性状或QTLs的选择和改良将会是一项艰巨的工作，因此，育种家们除了靠观察外，还需要大量的测交工作以确保有价值的性状在选择过程中不会丢失。在选择的过程中，优良种系的固定至关重要，杂种的状态使得这些优良种系不能及时固定下来而错失好的育种材料。无融合生殖和反向育种则很好地解决了这一问题，相对于无融合生殖，反向育种更易于操作。作为一种新型的育种工具，反向育种因为可以将复杂的基因型分离成纯合的，可以重现杂合基因型的互补亲本，用以制种或品种改良，使得其在未来的育种工作中可以发挥更大的作用。

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