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2023年3月，崖州湾国家实验室李靖教授、中国农业科学院农业资源与农业区划研究所易可可教授为共同通讯作者，其团队在NaturePlants（IF：18.6）上发表题为“A
simple and highly efficient strategy to induce both paternal and maternal
haploids through temperature manipulation”的短篇研究论文。
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单倍体细胞和生物体只包含一套染色体，通过单倍体的全基因组复制，可以在两代内产生一个完全同质的系，即双单倍体，而传统的近亲繁殖通常需要六到八代以上。因此，单倍体育种技术大大缩短了育种过程的时间和成本。体外配子体组织培养技术因程序繁琐、仅对少数物种有效且往往依赖于基因型而受到限制。而单倍体诱导剂提供了方便、成本效益，最重要的是，它们能够独立于基因型发挥作用，允许单倍体技术轻松融入传统和现代育种程序。GFP-tailswap是一种基于CENH3的诱导剂，能分别诱导父本和母本单倍体，但GFP-tailswap的雄性不育性限制了母本单倍体的诱导。本文研究提出了一种方法，通过温度控制来提高单倍体诱导效率，低温增强花粉活力而高温提高单倍体诱导效率，这种方法能显著提高母本单倍体的诱导率至24.8%，并简化父本单倍体的诱导过程。这些发现为利用基于CENH3的单倍体诱导剂提供了新的思路。大多数单倍体诱导剂以一个方向起作用，即母系或父系。然而，在拟南芥和 GFP-tailswap 中的 CENH3 功能研究过程中偶然发现的单倍体诱导物具有在两个方向上充当单倍体诱导物的能力。CENH3是着丝粒的表观遗传决定因素，可激活着丝粒的形成。与经典H3类似，CENH3具有保守的组蛋白折叠结构域，但其氨基末端尾部在长度和氨基酸序列上都存在高度差异。由于CENH3的关键功能，cenh3的无效等位基因cenh3-1会导致染色体分离失败，从而导致胚胎致死表型。为了通过嵌合CENH3构建体拯救cenh3-1胚胎，Ravi和Chan开发了一种在植物中构建单倍体诱导子的新方法，其中一种补体构建体GFP-tailswap（编码嵌合CENH3，其N末端尾部被H3.3的GFP标记尾部取代），恢复了cenh3-1的胚胎致死表型。但是，当所得的恢复后品系（也称为GFP-tailswap）与野生型CENH3植物的花粉受精时，鉴定出大量单倍体后代（20-40%），这表明GFP-tailswap是一种高效的父本单倍体诱导系。然而，父本单倍体的细胞质来源于诱导系，这限制了其在实践中的应用。除了作为父本单倍体诱导剂，GFP-tailswap也可以用作母本单倍体诱导剂，这提供了高度的灵活性。母本单倍体适用于更多场景，因为它们不受细胞质遗传信息的干扰。但是，当GFP-tailswap作为花粉供体进行单倍体诱导时，其单倍体诱导率（HIR）远低于作为父本单倍体诱导剂时，通常不超过5%。此外，GFP-tailswap的花粉活力极低，这使得诱导过程更具挑战性。这两个关键问题，尤其是花粉活力的严重缺陷，导致GFP-tailswap很少被用作母本单倍体诱导剂。因此，提高诱导系的雄性生育能力将是首要步骤。为了探究环境温度的影响，作者对在不同温度下生长的野生型Col-0和GFP-tailswap的花药进行了亚历山大染色测定。结果显示花粉活力在凉爽的环境温度（18℃）下完全恢复，但在相对温暖的环境温度（25℃）时下降的更严重，而野生型Col-0在以上条件下没有表现出任何显著差异（图1a）。![]()
随后，作者使用了恢复活力的花粉对一个无毛突变体gl1（Ler背景）进行授粉，该突变体在正常条件（22°C）下生长，以确定这些恢复活力的花粉是否可以用于母本单倍体的诱导。与GFP-tailswap植物（Col背景）相比，gl1 Ler突变体的花序更为紧凑。杂交后，研究发现大部分种子存活下来（图1c）。![]()
大约有1.6%的后代表现出无毛和紧凑花序的表型（扩展数据图3a），这些表型通常与单倍体相关；其中一些通过流式细胞仪分析已经得到了确认（扩展数据图3b，c）。在较低温度下，单倍体诱导率（HIR）远低于之前报道的5%，这表明与GFP-tailswap的雄性不育性类似，单倍体诱导可能对环境温度敏感。![]()
除了GFP-tailswap这种嵌合体之外，另一种GFP与CENH3直接融合的蛋白（GFP-CENH3）几乎完全恢复了cenh3-1突变体的表型，这表明GFP-CENH3对CENH3的功能影响很小。然而，当GFP-CENH3作为母本在正常条件下使用时，它仍然显示出较弱的单倍体诱导能力。此外，研究发现GFP-CENH3作为父本时，其单倍体诱导能力也对环境温度有响应；单倍体诱导率（HIR）随着温度的升高而增加，从18°C时的0%增加到22°C时的1.9%，再到25°C时的4.3%。许多研究已经证明，经过点突变或片段缺失的CENH3可以使植物变成单倍体诱导剂。因此，作者想知道其他基于CENH3的诱导剂是否也容易受到温度变化的影响，使用CRISPR-Cas9技术，获得了一个在CENH3的N端尾部缺失27个氨基酸的cenh3-8等位基因（扩展数据图5a，b）。![]()
实验结果表明，在正常条件下，cenh3-8的植物组织和花粉活力与野生型植物没有明显差异（扩展数据图5c，d）。![]()
他们进一步确定，生长温度的变化似乎不影响cenh3-8植物的生育能力（扩展数据图5d）。过往研究表明，CENH3的表达依赖于第二内含子内的内源性调控元件。与cenh3-8中第一和第二内含子的缺失相一致（扩展数据图6a），在所有温度条件下cenh3-8的CENH3表达水平都降低了（扩展数据图6b）。![]()
所有这些结果表明cenh3-8可能是CENH3的一个弱突变等位基因。与之前的研究类似，cenh3-1的杂合子自交产生了75.32%的正常种子（n = 158），这表明父母本任一方的CENH3突变体都足以支持种子发育。因此，如果cenh3-8是一个弱突变等位基因，cenh3-1/+和cenh3-8之间的互交将在两个方向上回补了种子表型。正如预期的那样，当cenh3-8植物作为花粉供体时，97.59%（n = 166）的种子正常发育（扩展数据图7）。但是当cenh3-8植物作为花粉受体时，只有78.79%（n = 165）的种子正常发育（扩展数据图7），这表明母本cenh3-8在种子发育过程中有严重的功能缺陷。![]()
因此，他们探究了cenh3-8品系以确定它是否具有诱导单倍体的能力以及它是否受环境温度影响。将cenh3-8突变体置于不同温度下生长，然后用gl1 Ler的花粉授粉，并在相同条件下继续生长。结果表明，在18°C和22°C的环境温度下无法诱导单倍体，但在25°C时，得到了13.6%的单倍体诱导率（HIR）（见图2a），这在30°C时进一步增加到28.6%（见图2a）。![]()
这些结果表明，像cenh3-8这样的突变等位基因在正常温度下没有诱导单倍体的能力，但在温暖的环境温度下可以获得诱导单倍体的能力。根据以上结果，更高的温度可以被用作一个共同因素来提高基于CENH3的诱导系的单倍体诱导能力。在这里，作者展示了基于CENH3的诱导剂的单倍体诱导能力通常依赖于环境温度。这一发现得到了最近一个研究的进一步支持，该报告指出一个弱等位基因cenh3-4（在CENH3基因第三外显子的剪接供体位点发生G到A的转换，导致中心粒上的CENH3显著减少），在高温下获得了单倍体诱导能力。因此，这些发现有了一定潜力能被直接用来增强基于CENH3的单倍体诱导剂的父本单倍体诱导能力。然而，正如前人的的研究，他们展示了单倍体诱导能力与种子流产率呈正相关，这可能会减少环境温度在单倍体诱导中的最终效果。为了验证温暖温度对GFP-tailswap单倍体诱导的增强效果，研究人员收集了在凉爽和温暖条件下，GFP-tailswap与Ler植物花粉供体之间每个杂交的五个长角果中的所有种子，并将它们分成如前所述的不同缩水等级的组。每组种子在1/2 MS培养基上发芽，然后移植到营养土中，然后分别分析他们的倍性水平。结果发现，被认为是黑暗不可存活的组中的种子也发芽了。最后，在凉爽条件下，获得了15株单倍体植物，其中大部分（15株中的10株）来自发育良好的饱满种子。当温度升高到25°C导致单倍体植物产量增加了一倍多，其中大部分（33株中的23株）来自严重皱缩（大小1/2）的种子。然而，当温度进一步升高到30°C时，所有产生的种子都被归类为黑暗不可存活，几乎没有种子从大约68个长角果（通过计算6个长角果，每个长角果26粒种子）中发芽。这些结果表明，在一定范围内提高环境温度可以有效增加GFP-tailswap的单倍体诱导效率。此外，对于在高温下完全雄性不育的诱导系，如GFP-tailswap，这种方法提供了额外的优势，因为它消除了去雄的过程，这减少了杂交的难度（特别是对于难以去雄的作物，如水稻、小麦和大豆）。然而，环境温度是否直接影响早期胚胎中诱导单倍体的能力，或者是通过配子体遗传以某种方式间接影响。为了解决这一担忧，作者在GFP-tailswap植物授粉后立即在凉爽和温暖的温度之间切换生长条件。在温暖（25°C）和凉爽（18°C）温度下生长的GFP-tailswap植物进行了去雄处理，第二天它们用在正常温度（22°C）下生长的植物收集的gl1 Ler花粉进行授粉。授粉后，一半的植物保持在原始条件，其余的植物立即转移到不同的温度条件下继续生长。结果发现，GFP-tailswap的单倍体诱导能力主要受授粉后环境温度的影响，而不是授粉前。对于原本在凉爽温度（18°C）下生长的诱导植物，当授粉后的诱导植物保持在18°C时，HIR（单倍体诱导率）大约为8.0%，而当植物转移到25°C时，它增加到79.7%（见图2b）。至于在温暖温度（25°C）下生长的诱导植物，当授粉后的诱导植物保持在25°C时，HIR约为80.5%，而当植物转移到18°C时，它下降到13.1%（见图2b）。因此，GFP-tailswap的单倍体诱导能力可能受到环境温度对单倍体胚胎形成直接影响。![]()
与父本单倍体相比，不含细胞质基因组干扰的母本单倍体在育种中非常受欢迎。GFP-tailswap具有诱导母本单倍体的能力，但其单倍体诱导率（HIR）与父本单倍体诱导相比非常低。诱导植物的花粉活力严重缺陷也使得在生产实践中难以利用这一品系。实验结果表明，环境温度对GFP-tailswap诱导植物在母本单倍体诱导方面表现出一对阴阳效应。凉爽的温度增加了花粉活力，同时降低了HIR，而温暖的温度则相反。但进一步实验证明了这些阴阳效应是可以分离的，这激励作者设计了一种策略，通过简单地切换环境温度来解决GFP-tailswap母本单倍体诱导的两个关键问题（低花粉活力和低HIR）。gl1
Ler植物在正常温度（22°C）下生长至开花，而诱导植物在凉爽温度（18°C）下生长以收获恢复活力的花粉。去雄后，gl1植物用恢复的诱导花粉授粉，然后授粉的植物被转移到更高的温度（22°C和25°C）进行单倍体诱导（图3a，b）。结果发现，与始终保持在凉爽温度（18°C）的植物的HIR为1.6%相比，授粉后转移到正常温度（22°C）的植物的HIR增加到7.0%，进一步增加到温暖温度（25°C）的授粉后植物的HIR为24.8%（图3b）。环境温度对单倍体诱导剂的阴阳效应的发现，引导开发了一种简单的策略，解决了GFP-tailswap在母本单倍体生产中的两个关键限制。![]()
在本研究中，发现通过提高环境温度来增强单倍体诱导可能是基于CENH3的单倍体诱导剂的一个共同特征。在作物中基于CENH3开发单倍体诱导剂的尝试并没有像预期的那样成功，已经生产的诱导剂达到的单倍体诱导能力相对较低。因此，在大多数情况下，低单倍体诱导率（HIR）是单倍体诱导中需要首先解决的问题。作者认为通过提高环境温度来增强HIR为优化基于CENH3的单倍体诱导方法提供了重要潜力，并且值得探究环境温度是否对其他单倍体诱导系统有类似的影响，包括基于MTL和DMP的系统。然而，当HIR被优化到一个较高水平时，必须在HIR和种子败育率之间取得平衡。例如，在30°C下使用GFP-tailswap诱导父本单倍体时，几乎观察不到发芽。本文的发现不仅对实际的单倍体生产有益，而且还为与基因组消除相关的机制提供了重要的见解。CENH3被众所周知在维持有丝分裂和减数分裂过程中染色体分离中扮演着关键角色。GFP-tailswap品系中嵌合体CENH3的功能缺陷使得植物获得了单倍体诱导能力，同时伴随着雄性配子体的不育。尽管如此，对于这些过程如何在植物中调节知之甚少。根据前人的研究，res1（一个cdka;1的弱等位基因）能够在许多TGMS突变体中恢复雄性生育力，低温被认为能够像res1一样减慢雄性减数分裂的进程。通过将res1与GFP-tailswap杂交，获得了具有纯合res1背景的GFP-tailswap诱导剂。结果发现res1无法恢复GFP-tailswap的雄性不育表型（扩展数据图8）。这表明环境温度在GFP-tailswap和花粉壁相关的TGMS突变体之间可能有不同的作用机制。![]()
在这里，本文展示了GFP-tailswap的不育性和单倍体诱导能力是温度依赖的，最重要的是这些效应是分开的。结果因此表明，在拟南芥中的基于CENH3的单倍体诱导剂和玉米中的Stock-6衍生单倍体诱导剂之间存在不同的单倍体诱导机制。在玉米中，人们认为在CAU5（一个从Stock
6衍生的母本单倍体诱导线）的精子细胞中观察到的染色体断裂是导致雄性配子体不育和随后形成雌性单倍体的原因。本研究显示GFP-tailswap的不育性和单倍体诱导能力受温度影响，且这两种效应是独立的，这表明拟南芥中基于CENH3的单倍体诱导剂与玉米中Stock-6衍生的单倍体诱导剂在机制上存在差异。在玉米中，CAU5诱导系（一个母本单倍体诱导系）的精子细胞中的染色体断裂与雄性配子体不育和雌性单倍体形成有关。前人研究发现从GFP-tailswap植物继承的染色体在胚胎细胞分裂期间的消除可能与染色体DNA损伤有关，而非精细胞遗传。此外，cenh3-8和Δ11（CENH3
N端尾部αN螺旋完全缺失）的研究揭示了CENH3在减数分裂中的功能和对温度变化的敏感性。尽管CENH3的N端尾部对减数分裂至关重要，但过程似乎能容忍该尾部两端的片段缺失。Δ11表现出较高的HIR，而cenh3-8只在高温下有效，这可能与CENH3不同保守度的域上的突变有关。这些现象背后的具体机制尚不清楚，需要进一步研究CENH3的各个功能域以及环境温度如何与CENH3协调，以调控减数分裂和有丝分裂期间的染色体分离。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41477-023-01389-x?utm_source=xmol&utm_medium=affiliate&utm_content=meta&utm_campaign=DDCN_1_GL01_metadata![]()
