一种提高公牛精子体外质量的新方法：凝集素功能化铁磁性纳米颗粒的精子筛选法

2024-11-10 11:36 北京

Paul, N., Kumaresan, A., Talluri, T. R., Raval, K., Elango, K., Pradeep Nag, B. S., Duraisamy, R., & Manimaran, A. (2024). Lectin Functionalised Iron Magnetic Nanoparticle-Based Sperm Selection: A Potential Technique to Improve Bull Sperm Quality In Vitro. Reproduction in Domestic Animals, 59, e14733. https://doi.org/10.1111/rda.14733

在畜牧生产中，优质精子是实现最佳繁殖效率的前提条件。然而，在过去的数十年中，雄性不育的发生率在增加，精液生产能力也呈下降趋势（Esteves et al., 2012; Levine et al., 2022）。特别是在牛上，虽然种用公牛是基于优越的遗传特性来进行选择的，但有相当比例的所选种公牛产生的精液质量却不理想（Butler et al., 2020）。据报道，杂交公牛（Bos taurus × Bos indicus）劣质精液的平均发生率约为52%至55%（Kumaresan et al., 2021），危及牛的遗传改良计划。年龄、遗传构成、饲养条件、健康、环境、季节和冷冻保存等多种因素都对精液的质量造成不利影响（Fiaz et al., 2010; Murphy et al., 2018）。现在人们普遍认为，在同次所采集的精液中并非所有精子的表型和功能特性上都是相同的，即同批次所采精液中存在具有不同受精潜力的精子亚群。研究表明，与低繁殖力的雄性相比，高繁殖力的雄性家畜产生的精液中含有较高比例的具有优越表型和功能特性的精子，这在公牛（Kumaresan et al., 2017; Kumaresan, Johannisson, & Bergqvist, 2017; Saraf et al., 2019; Vignesh et al., 2020）、公水牛（Singh et al., 2016; Paul et al., 2021）和公猪（Kumaresan et al., 2012）中都是如此。基于精子表型/功能属性的差异，可以高精度地区分高于和低于平均繁殖力的公牛（Kumaresan et al., 2017; Kumaresan, Johannisson, & Bergqvist, 2017）。这些发现表明，有可能从特定的精液中去除不需要的精子，并使用剩余的富含优质精子的那部分进行授精。在冷冻保存过程中，精子顶体的损伤或过早的顶体反应是影响繁殖力的主要不利变化之一，与繁殖力呈负相关（Sun et al., 2021; Thundathil et al., 1999）。为了实现有效受精，完整的顶体对于精子穿入和随后的卵母细胞激活至关重要。据报道，在冷冻保存后，大约三分之一的顶体完整的活精子转化为活着的顶体反应精子或死亡的顶体反应精子（Paudel et al., 2010）。过早的顶体反应和精子无法对适当的刺激释放顶体内容物（顶体反应不足）已知与特发性雄性不育有关（Esteves & Verza Jr, 2011）。因此，从特定的精液样本中去除顶体反应精子群体可以提高生育力。

死精子在精液中的存在不仅影响精子的总体活力，还可能因为其释放的有害化学物质对活精子产生负面影响，如增加活性氧（ROS）的产生，从而影响活精子的功能和受精能力（Agarwal et al., 2014）。因此，开发有效的死精子去除技术对于提升精液质量具有重要意义。近年来，磁性纳米颗粒技术在生物医学领域，尤其是在细胞分离和生物标记方面显示出巨大潜力。这些纳米颗粒可以被功能化，以特异性地结合到细胞的特定标记物上，通过外加磁场实现对目标细胞的快速分离（Odhiambo et al., 2014）。在精子筛选领域，凝集素功能化的磁性纳米颗粒（MNPs）因其能够特异性识别和结合到精子表面的特定糖基化结构而受到关注。例如，花生凝集素（PNA）能够识别精子顶体上的特定糖基，而FITC-PNA结合的铁磁性纳米颗粒可以用于标记和分离顶体反应的精子（Ben-David Makhluf et al., 2006）。结合这些技术，研究者们尝试开发一种新型的精子筛选技术，即利用FITC-PNA结合的铁磁性纳米颗粒（MNPs）来选择性地去除反应性精子，包括死精子和早期顶体反应的精子。这种技术的优势在于其高效性和特异性，能够显著提高精子的纯度和质量，为提高人工授精和辅助生殖技术的成功率提供了新的可能（Durfey et al., 2019）。

近期，来自印度的研究人员，建立并评估了使用荧光素异硫氰酸酯-花生凝集素（FITC-PNA）结合的铁磁性纳米颗粒（MNPs）选择性去除反应性精子的一种新技术，以提高冷冻保存公牛精液的质量，并进一步评估纳米纯化对精子其他功能属性的影响。他们通过共沉淀法制备了铁MNPs，并与FITC-PNA结合。初步实验确定了0.6 mg FITC-PNA结合的铁MNPs能有效去除反应性精子。

使用6头荷斯坦弗里斯兰种公牛的冷冻精液进行实验。精液解冻后，使用Sperm-TALP清洗以去除残留的扩展剂。将洗涤后的精子（2×10^6）暴露于0.6 mg的FITC-PNA结合铁MNPs中，37°C下处理10分钟。使用流式细胞仪评估纳米纯化精液的各种重要精子参数，如活力、细胞内钙、凋亡、线粒体ROS和线粒体膜电位。

具体的研究结果如下：

1. 精子活力（Viability）：

- 纳米纯化显著提高了精子的活力。在纳米纯化组中，活力精子的比例显著（p < 0.01）高于对照组，分别为65.68% ± 4.74%和46.58% ± 1.4%。

- 纳米纯化组中凋亡和死亡精子的比例显著（p < 0.01）低于对照组，分别为32.32% ± 4.44%和22.21% ± 4.327%。

2. 线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential, MMP）：

- 纳米纯化组中具有高MMP的精子比例高于对照组，表明纳米纯化能够保留具有较高能量代谢能力的精子。

3. 活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）：

- 在对照组和纳米纯化组之间，线粒体ROS的产生没有显著差异。这表明纳米纯化过程并未对精子的氧化应激状态产生负面影响。

4. 细胞内钙（Intracellular Calcium）：

- 纳米纯化组中活细胞内钙负精子的比例显著（p < 0.01）高于对照组，分别为38.81% ± 1.98%和27.69% ± 1.79%。

- 纳米纯化组中具有高细胞内Ca2+含量的活精子比例显著（p < 0.01）低于对照组，分别为19.88% ± 3.09%和22.98% ± 2.85%。

5. 凋亡（Apoptosis）：

- 纳米纯化组中活且非凋亡精子的比例显著（p < 0.01）高于对照组，分别为62.14% ± 2.5%和52.02% ± 2.5%。

- 总凋亡精子比例在纳米纯化组中较低，但差异不显著。

上述结果表明，使用FITC-PNA结合铁MNPs的纳米纯化技术能够有效地从冷冻保存的公牛精液中去除反应性精子，同时保留具有较高活力、较低凋亡率和较低细胞内钙水平的精子。这种技术还保持了精子的线粒体功能，包括MMP和ROS水平，这对于精子的受精能力至关重要。通过纳米纯化技术，能够显著提高精子样本的质量，这对于提高人工授精和辅助生殖技术的成功率具有重要意义。这些发现为进一步的研究和应用提供了坚实的基础，尤其是在提高家畜繁殖效率方面。然而，需要进一步的体内研究来验证这些体外结果是否能够转化为实际的繁殖力提高。

参考文献：

Agarwal, A., Virk, G., Ong, C., & Du Plessis, S. S. (2014). Effect of oxidative stress on male reproduction. World Journal of Men's Health, 32(1), 1-17.

Ben-David Makhluf, S., Qasem, R., Rubinstein, S., Gedanken, A., & Breitbart, H. (2006). Loading magnetic nanoparticles into sperm cells does not affect their functionality. Langmuir, 22(23), 9480-9482.

Durfey, C. L., Swistek, S. E., Liao, S. F., et al. (2019). Nanotechnology-based approach for safer enrichment of semen with best spermatozoa. Journal of Animal Science and Biotechnology, 10(1), 1-12.

Esteves, S. C., Zini, A., Aziz, N., Alvarez, J. G., Sabanegh, E. S., & Agarwal, A. (2012). Critical appraisal of World Health Organization's new reference values for human semen characteristics and effect on diagnosis and treatment of subfertile men. Urology, 79(1), 16-22.

Levine, H., Jørgensen, N., Martino-Andrade, A., et al. (2022). Temporal trends in sperm count: A systematic review and meta-regression analysis of samples collected globally in the 20th and 21st centuries. Human Reproduction Update, 29(2), 157-176.

Butler, M. L., Bormann, J. M., Weaber, R. L., Grieger, D. M., & Rolf, M. M. (2020). Selection for bull fertility: A review. Translational Animal Science, 4(1), 423-441.

Kumaresan, A., Elango, K., Datta, T. K., & Morrell, J. M. (2021). Cellular and molecular insights into the etiology of subfertility/infertility in crossbred bulls (Bos taurus × Bos indicus): A review. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 9, 696637.

Fiaz, M., Usmani, R., Abdullah, M., & Ahmad, T. (2010). Evaluation of semen quality of Holstein Friesian and Jersey bulls maintained under subtropical environment. Pakistan Veterinary Journal, 30(2), 75-78.

Murphy, E. M., Kelly, A. K., O'Meara, C., Eivers, B., Lonergan, P., & Fair, S. (2018). Influence of bull age, ejaculate number, and season of collection on semen production and sperm motility parameters in Holstein Friesian bulls in a commercial artificial insemination centre. Journal of Animal Science, 96(6), 2408-2418.

Odhiambo, J. F., DeJarnette, J., Geary, T. W., et al. (2014). Increased conception rates in beef cattle inseminated with nanopurified bull semen. Biology of Reproduction, 91(4), 1-10.

Sun, W., Jiang, S., Su, J., et al. (2021). The effects of cryopreservation on the acrosome structure, enzyme activity, motility, and fertility of bovine, ovine, and goat sperm. Animal Reproduction, 17(4), e20200219.

Thundathil, J., Gil, J., Januskauskas, A., et al. (1999). Relationship between the proportion of capacitated spermatozoa present in frozen-thawed bull semen and fertility with artificial insemination. International Journal of Andrology, 22(6), 366-373.

Esteves, S. C., & Verza Jr, S. (2011). Relationship of in vitro acrosome reaction to sperm function: An update. Open Reproductive Science Journal, 3(1), 72-84.

Paudel, K., Kumar, S., Meur, S., & Kumaresan, A. (2010). Ascorbic acid, catalase and chlorpromazine reduce cryopreservation-induced damages to crossbred bull spermatozoa. Reproduction in Domestic Animals, 45(2), 256-262.

来源：海哥牛羊繁育技术新动态

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