牙本质是一种独特的，无血管的矿化结缔组织，形成了牙齿的大部分。它包围在牙髓组织外面。牙本质由成牙本质细胞分泌，其构造分基质和牙本质小管-纤维两部分。在光学显微镜下可见到牙本质内有许多紧密排列的小管，小管与小管间是基质。
牙本质基质中主要的细胞外基质蛋白是一种富含天冬氨酸和丝氨酸的蛋白质，称为牙本质磷酸化蛋白（DPP）。用 DPP 处理的祖干细胞会刺激细胞内钙的释放，钙的消耗会引发许多下游反应。
DPP 可激活 DPSCs（牙髓干细胞）中的 Wnt 信号通路。先前的研究表明，Wnt 信号通路是牙齿形成所必需的。了解介导成体干细胞分化以再生牙本质-牙髓复合体的分子机制对再生牙科医学至关重要。这个过程需要细胞增殖和分化之间的微妙平衡。
在牙齿发育过程中，Wnt5a mRNA 在发育中的成牙本质细胞中广泛表达，Wnt5a 缺陷小鼠的成牙本质细胞分化延迟，牙齿较小且形状异常。哺乳动物基因组编码 19 种 Wnt 蛋白和几种受体，这些成分相互作用的方式表明在牙齿发育过程中上皮和间充质细胞中存在动态且严格控制的表达模式。然而，关于 Wnt5a 在牙齿间充质中激活的机制的信息很少。
基于此，来自伊利诺伊大学芝加哥分校的研究人员揭示了细胞外基质蛋白 DPP 通过诱导 Wnt5a 介导的信号通路，促进成体干细胞分化为牙源性谱系的分子机制。相关成果以“DPP an extracellular matrix molecule induces Wnt5a mediated signaling to promote the differentiation of adult stem cells into odontogenic lineage”为题发表在 Scientific Reports 上。华人学 者 Yinghua Chen 为本文一作。
研究人员首先发现 DPP 和 Wnt5a 由 DPSCs 作为外泌体分泌，且 DPP 刺激了 Wnt5a 的分泌。免疫染色结果显示：Wnt5a 和 DPP 存在于 DPSCs 的细胞外基质中。
随后，为了证明 DPP 刺激可诱导 Wnt5a 的表达，对不同 DPP 浓度培养基中培养的细胞总蛋白进行 Western Blot 检测，结果显示：Wnt5a 蛋白的表达随着 DPP 的刺激而持续增加，并且其表达水平一直维持到 72 h。为了证明 DPP 介导的 Wnt5a 的分泌，研究人员对 DPP 和抑制剂 TPCA-1 刺激的 DPSCs 的分泌组进行实验测试。实验结果均证实了 DPP 刺激了 Wnt5a 的分泌，而该活性通过阻断 TPCA-1 的 NF-ĸB 信号通路而被抑制。
研究人员接下来证明了 DPP 刺激诱导 Wnt5a 依赖的稳定性，分析 DPP 介导的 Wnt5a 激活是否可以协调β-连环蛋白向细胞核的易位。用 DPP 对细胞进行不同时长处理发现，在 DPP 刺激 5min 时，β-Catenin 的核定位就开始积累。而通过 Wnt5a 拮抗剂 Box5 预处理破坏 Wnt5a 与其受体之间的相互作用，DPP 刺激下β-连环蛋白的核易位水平降低。这些研究证实了 DPP 介导的 Wnt5a 激活促进了β-连环蛋白的核易位，并且在没有 Wnt5a 的情况下，它们的易位可能会被终止。
此前，研究人员已经证明了 DPP 刺激可以上调关键的牙源性基因如 RUNX2、OSX、ALP 和 OCN29 的表达。为了进一步分析作用机制，研究人员增加这些转录本，观察其是否受到 Wnt/β- 连环蛋白信号通路的调控。结果显示，在没有抑制剂的情况下，DPP 处理的 DPSCs 有效地显示了 RUNX2、OSX、ALP、氰酸盐和 DMP1 的表达增加。相反，用 Wnt/β- 连环蛋白通路抑制剂和 DPP 刺激预处理 DPSCs，导致基因表达降低。
随后，研究人员通过一系列实验证明了 DPP 激活 Wnt5a/β- 连环蛋白信号通路的分子机制。特异性 Wnt 受体的可用性是决定 Wnt 信号下游靶点的特异性和表达强度的关键因素。DPP 刺激通过典型和非典型信号通路促进 Wnt5a 与受体信号通路的共定位，促进 Wnt5a 在细胞膜上与 Ror2 受体的结合并随后的内化。以上实验结果均验证了 DPP 可以激活下游的信号事件，导致成牙本质细胞极化。
为了研究 DPP 介导的牙源性分化是否需要 Wnt5a，研究人员使用 CRISPR 构建了一个 DPSC/Wnt5a KO 细胞系。为了评价 DPSC 和 DPSC/Wnt5a 的牙源性分化潜能，将 KO 细胞在有/无 DPP 的分化条件下培养 3 周。收集细胞，通过 Real-time PCR 检测关键牙源性标记物的表达。结果显示：促牙源性转录因子 RUNX2 和 OSX 在分化、刺激过程中表达增加，DPP 的加入会增加这种表达，而在 Wnt5a KO 的基因缺陷细胞中，牙源性标记物的表达水平降低。
图 | DPP 介导的 Wnt/βcatenin 信号通路对 DSPP 向成牙细胞系终末分化的影响
此外，研究人员证实了在 DSPP 缺失的转基因小鼠中 Wnt5a 信号通路受损。Wnt5a 及其信号成分的定位模式证实了在 DPP 缺失的情况下， Wnt 信号通路受损。与细胞水平的实验结果一致。
图 | Wnt5a 和 Wnt5a 信号成分在 WT 和 DSPP-KO 小鼠中的表达
综上所述，在牙髓中发现的成体干细胞是牙本质修复和再生的重要细胞来源。在 DPSC 的牙源性分化过程中，有几个信号事件被激活。研究人员证明了基质中的 DPP 可以激活 Wnt5a 介导的信号通路，促进其向成牙本质细胞分化。因此，DPP 介导的 Wnt5a 信号通路可能是受损牙本质矿化修复和再生的治疗靶点，为成牙再生提供了新的视角和理论支持。
