一半以上癌症驱动突变发生于抑癌蛋白，少部分则发生于癌蛋白。靶向抑癌蛋白需要史无前例地恢复（而非常规地抑制）蛋白功能，尚无成功先例。抑癌蛋白 p53 是生物医学历史上被研究最多的蛋白，医学领域对 p53 恢复剂的探索热情不亚于物理学领域对室温超导体的探索热情——已有至少 71 个团队在 Science、Nature 等期刊报道获得 p53 恢复剂，并进入超过 23 项临床试验，治疗了 1000 多位癌症患者。遗憾的是，绝大多数 p53 恢复剂在实验室都检测不到活性，在临床上迄今未能观察到任何具有统计学显著的患者获益。
上海交通大学医学院附属瑞金医院卢敏早期揭示了癌症中 p53 功能丧失的新机制，近年来设计 p53 功能恢复策略并揭示其结构学机制，并获得迄今唯一有效的 p53 恢复剂 ATO，之后首次在人体内实现p53 突变体功能恢复。
2024 年 11 月 1 日，卢敏为独立通讯作者，宋花歆、肖淑君、吴嘉祺为共同第一作者，在 Cancer Discovery 发表综述论文，以“Drugging p53: Barriers, Criteria, and Prospects”为题，提出 p53 恢复剂的研究规范，涉及7个主题：p53 恢复剂研究中缺失的科学逻辑、长期以来对 p53 突变体的误解、p53 恢复剂的研发障碍、p53 恢复剂有效性的评估标准、p53 恢复剂的临床试验规范、p53 恢复剂的研发经验教训、p53 的成药前景。
主题一：唯一具科学逻辑的 p53 功能恢复策略（靶向蛋白折叠策略，TPF）
p53 主要通过与 DNA 结合并转录激活其下游的靶基因来发挥抑癌功能。癌症中至少存在数千种不同的 p53 突变，这些突变通过各种不同的机制削弱 p53 与 DNA 的结合能力，从而削弱其抑癌功能[13]（图A，蓝色框）。
某些突变正好发生于 p53 的 DNA 结合氨基酸（通常是带正电的精氨酸），导致这些突变体无法结合 DNA，从而失去抑癌功能，这一类突变体被称为“DNA 结合型突变体”。至今不存在（短期的将来应该也不会出现）可以理解的、针对这些突变体的功能恢复策略。作为一个重要的转录因子，p53 进化出的 DNA 结合氨基酸可以与 DNA 的大沟和小沟在形状、电荷、朝向上完美匹配。很难想象一个小分子可以在形状、电荷、朝向上弥补因突变而缺失的精氨酸，此外还可以消除因突变而出现的新氨基酸所带来的负面影响。虽然已有研究报道某些化合物可以插入 p53 与 DNA 的结合面[24]，但预期这些化合物只会削弱 p53 的 DNA 结合能力。p53 C277Y 和C277W是功能完全丧失的突变体（具体功能丧失数据见www.rescuep53.net），正好证明了这一点（注：C277Y 和 C277W 这两个突变在 DNA 结合氨基酸 Cys277 上引入大尺寸的氨基酸 Y 和 W，因此可以较好地模拟这些插入 p53 和 DNA 结合面的化合物）。总之，DNA 结合型突变体不太可能通过药物恢复功能，而只能通过基因工程手段进行功能恢复，例如通过基因突变重新引入可以结合DNA的精氨酸[25]。
另一些突变则发生于维持 p53 三级结构的氨基酸，导致 p53 不能折叠出三级结构，进而不能结合 DNA 并失去功能，这类突变被称为“结构型突变体”。作为生物化学、结构生物学的一项基本原理（也是分子生物学教科书中的基本知识点），蛋白质的折叠由“氨基酸胶水”（例如疏水作用、氢键、二硫键等）驱动[26]，这些“氨基酸胶水”将蛋白内部的 2 个或多个氨基酸胶联在一起（图B）。一个典型的例子是在核糖体中新合成蛋白的折叠过程，这亦是一项基本的生命过程。在癌症中，造成 p53 内部空腔化的突变（如F270L 和 V143A 等突变[27]在 p53 内部从大尺寸氨基酸变成小尺寸氨基酸）和扰乱 L2-L3 结构的突变（如R175H、R249S 和 C242S 等使 L2 和L3 相互作用丢失的突变）都导致 p53 中某些关键“氨基酸胶水”的丢失，进而导致 p53 从折叠状态转变为非折叠状态。反过来，当一个小分子结合到某个蛋白内部的口袋中时，它通常会提高蛋白的热稳定性（亦即结构稳定性）和折叠能力（亦即蛋白复性）[28]，因为它在口袋中创造了新的“氨基酸胶水”，将蛋白内部的多个氨基酸胶连到一起（图B）。这里，我们将促进蛋白折叠并恢复蛋白功能的靶向策略取名为靶向蛋白折叠策略（Targeted Protein Folding，TPF），类比于已经得到广泛应用的靶向癌蛋白的靶向蛋白抑制策略（Targeted Protein Inhibition，TPI）和新兴的靶向蛋白降解策略（Targeted Protein Degradation，TPD）。据我们所知，TPF是目前唯一具有科学逻辑的p53功能恢复策略，但该策略只适用于结构型p53突变体。
总之，任何靶向药物的研究都必须遵循科学逻辑，p53 恢复剂研究也不例外，世界上并不应该存在可以不遵守科学逻辑的“神奇”的 p53 恢复剂。
主题二：4 项对 p53 突变体的误解
关于 p53 突变体，有四个普遍存在的误解。
第一个常见的误解是相信存在一种“神奇的”万能 p53 恢复剂，可以恢复所有不同 p53 突变体的抑癌功能[6, 13, 29, 30]。然而，基于 p53 突变体多样的失活机制（图A，蓝色框），很容易得出结论：任何一个 p53 恢复剂，只可能适用于失活机制与该恢复剂的工作机制一致的 p53 突变体。遗憾的是，当前许多实验室的基础研究仍然随意选择一个 p53 突变体进行研究。这种误解进一步导致临床医生在开展临床试验时，未对患者的 p53 突变类型进行分类，而是选择携带任意p53 突变的患者进行临床试验。令人难以置信的是，领域内已经有几十个团队宣称获得了 p53 恢复剂，然而几十年过去了，这些团队仍没有鉴定其恢复剂可适用的 p53 突变体清单，而是泛泛地将之用于所有 p53 突变体的功能恢复[31-35]。
第二个误解是认为可以通过传统的低温实验条件来评估结构型 p53 突变体的折叠情况。蛋白的折叠和不折叠状态是由其熔解温度（Tm）决定。在人体内，（在发生凝集沉淀之前）蛋白一直处于“折叠-不折叠”的动态转化过程中，当环境温度（Tambient）高于蛋白的 Tm 时，蛋白会趋向不折叠，反之则趋向折叠。野生型 p53 的 Tm 值约为 42°C，因此在人体中（37°C）趋向折叠状态。而结构型突变体由于缺失若干“氨基酸胶水”，Tm 值通常在 20–37°C 之间，因而在人体中处于非折叠状态并失去功能。需要注意的是，这些结构型突变体的 Tm 值仍远高于4°C，这意味着它们在传统 4°C 实验条件（注：为防止抗体失活，一般涉及抗体的实验都在 4℃ 下开展）下仍保持折叠状态，不能真实反映他们在人体内的非折叠状态。因此，评估结构型 p53 突变体折叠状态的实验（如特异性识别折叠 p53 的PAb1620 抗体的相关实验、特异性识别非折叠 p53 的 PAb240 抗体的相关实验）应在室温或更高温度下开展，以准确反映其在体内的非折叠状态[36]。遗憾的是，目前几乎所有评估 p53 折叠状态的实验都只能依赖这些结构表位抗体且在 4℃ 下开展。
第三个误解是认为“用小分子修饰 p53 表面的一个半胱氨酸可以促进 p53 折叠（亦即可以提高 p53 的 Tm 值）”。正如前文所述，蛋白的折叠主要由“氨基酸胶水”胶连蛋白内部的 2 个或多个氨基酸所驱动（图B）。这一基本概念得到了几乎所有约 495 个处于临床阶段和所有约 85 个获批的抗肿瘤靶向小分子的验证[37, 38]——这些靶向小分子结合靶蛋白内部的口袋，提供了“氨基酸胶水”，因此往往能提高靶蛋白的 Tm 值。遗憾的是，目前大量 p53 恢复剂都被认为是通过修饰 p53 表面的单个半胱氨酸来提高 p53 的 Tm 值[39]（图B），然而，这完全不符合科学逻辑，世界上并没有如此“神奇”的促折叠机制。
第四个误解是认为结构型 p53 突变体会错误折叠（misfolded）。[18-20, 23, 40]。结构型 p53 突变体的 Tm 值低于人体体温 37°C，因此，它们在人体内处于非折叠状态（unfolded），没有任何三级结构（图C，子图i）。在特定条件下，当 Tm 值重新大于环境温度时（例如通过小分子结合 p53 的口袋以提高 p53 的 Tm 值、通过基因工程方法在第二位点导入促结构稳定突变来提高 p53 的Tm 值、降低环境温度），这些突变体会重新折叠，折叠后会出现两种情况：第一种是重新折叠成和野生型 p53 完全一样的三级结构（图C，子图ii），第二种是重新折叠成在整体上和野生型 p53 一致但在局部区域包含一个无序的 L3 环（图C，子图iii）。第二种情况往往是领域内认为 p53 突变体会 misfold 的原因。“Misfolded conformation”这个术语通常用于描述一种非野生型的、固定的、对应于某种特定新功能的构象，而结构型 p53 突变体在重新折叠以后，其 L3环在第二种情况下既不固定、也不对应特定的新功能。因此，世界上根本不存在“错误折叠”的 p53，这些所谓的“错误折叠”的 p53 实际上是“不折叠”的 p53。所以领域内的研究目标应该定位于“使不折叠的 p53 蛋白重新折叠”，而非神奇地“纠正 p53 的错误折叠构象”。
主题三：4 项研发 p53 恢复剂的障碍
在过去的 25 年中，至少有 71 种 p53 恢复剂被报道。绝大多数已报道的 p53 恢复剂都是广谱性恢复剂，这里我们归纳了 4 个研发广谱性 p53 恢复剂的障碍。在癌症靶向治疗的发展史上，尽管已有数百个靶向小分子药物进入临床阶段（约 495 个），并且有约 85 个获批临床使用，但极少有在未克服这 4 个障碍的情况下就可以宣称自己是靶向小分子。遗憾的是，在众多宣称的广谱性 p53 恢复剂中，除三氧化二砷（ATO）和其类似物以外，这四个障碍无一被克服。
第一个障碍是缺乏可以解释恢复剂工作机制（mechanism of action，MoA）的结构学模型——这是定义一个小分子是否为靶向小分子的关键。如上文所述，修饰暴露的单个半胱氨酸以恢复结构型 p53 突变体蛋白折叠的结构学模型不能解释其 MoA。在几十个宣称的广谱性 p53 恢复剂中， ATO 及其类似物因具有可以解释 MoA 的结构学模型而脱颖而出——通过将蛋白内部的 Cys124、Cys135 和 Cys141 氨基酸胶联在一起，从而促进结构型 p53 突变体折叠。因此，ATO 倾向于恢复那些发生在“溶剂可及性低”的氨基酸上的突变，因为这些氨基酸位于蛋白内部所以更可能是负责维持 p53 三级结构的氨基酸，因而产生的突变体更可能是结构型突变体。
第二个障碍是缺乏对构效关系（structure-activity relationship，SAR）的理解。SAR 对于药理学家验证上述结构学模型、挑选出最具潜力的候选化合物以开展昂贵的临床试验都至关重要。目前，绝大多数广谱性 p53 恢复剂都缺乏这些至关重要的 SAR 研究。ATO 及其类似物是例外：在其结构学模型中，它们释放砷或锑原子与 p53 结合；在其SAR中，含有稳定的砷（或锑）-碳键的含砷（或锑）化合物不能释放砷（或锑）原子，而这些化合物不能恢复 p53 突变体的功能，因此 ATO 及其类似物不仅有 SAR 研究而且 SAR 结果与结构学机制相互兼容。
第三个障碍是缺乏对细胞中靶点特异性的研究——这是靶向小分子药物在人体内与其靶蛋白结合以调控其功能的基础。简单地说，靶点特异性主要取决于小分子与其结合口袋的互补性。然而，当前大多数广谱性 p53 恢复剂所谓的“MoA”是结合 p53 上暴露的某个巯基，这一过程仅仅涉及 p53 表面的一个半胱氨酸而不涉 p53 的任何口袋，因此这些恢复剂不可能具有 p53 结合特异性。确实，在 p53 的 10 个半胱氨酸中，这些恢复剂可以随意地结合到所有 5 个暴露的半胱氨酸，此外它们还被证实可以结合各种各样的携带暴露巯基的细胞内蛋白，以及细胞质中超高浓度的含有巯基的谷胱甘肽。相比之下，砷和锑原子同时结合 p53 内部三个空间距离靠近的巯基，因此在同基因型的细胞模型中展示出对 p53 这个靶点的较高特异性。这种特异性源于砷原子天生的化学性质：它需要同时结合三个巯基（砷原子几乎不结合双巯基或单巯基），而且这三个巯基之间的相互距离必须刚好合适（以便刚好能和砷原子形成 3 根共价键），而且这三个巯基还不能被 Zinc 占据。细胞中适合砷结合的蛋白口袋（即由空间距离靠近的三个巯基组成的口袋）的数量可能很有限。具我们所知，p53 是唯一一个具有共结晶结构证据的砷原子结合蛋白。
第四个障碍是缺乏明确的可适用突变体的清单。这一点至关重要，因为只有明确知道哪些突变体可适用于被研究的靶向药物，临床试验才可能精准入组患者。如前文所述，即使是广谱性 p53 恢复剂，也不可能恢复所有 p53 突变体的功能。比如，通过靶向蛋白折叠策略（TPF）所研发的 p53 恢复剂，仅能恢复结构型 p53 突变体的功能。更复杂的是，即使在这些结构型突变体内部，TPF 策略对不同突变体的恢复效率也存在差异。温度敏感（temperature sensitive，TS）亚型结构型突变体通常是最容易被 TPF 策略恢复功能的突变体。温敏型突变体的定义是：能够在环境温度（Tambient）降低时恢复功能的突变体。由于降低 Tambient 使“Tm > Tambient”成立，这将促进结构型 p53 突变体的重新折叠，因此可以推断 TS 型 p53 突变体是一类重新折叠以后能够组装出完整 DNA 结合面（从而恢复 DNA 结合能力和肿瘤抑制功能）的 p53 突变体（图 1C，子图 ii）。典型的温敏型突变（如 β-sandwich 内的各种突变、V272M、R282W）通常发生在离 DNA 结合表面的区域，这使得在 p53 重新折叠过程中能够组装出完整的 DNA 结合面。因此，任何能够促进“Tm > Tambient”这个不等式成立的策略，包括 ATO 及其类似物的药物学策略、在第二位点引入结构稳定性突变的遗传学策略、降低环境温度的策略，都倾向于恢复 TS 亚型结构型 p53 突变体的功能。反过来，非温敏型的结构型突变体是那些即使（被低温诱导）重新折叠也无法组装出完整 DNA 结合面的突变体（图 1C，子图 iii），支持证据包括：典型的非温敏亚型或低温敏亚型的结构型突变体（如 R249S、G245S、应该还包括 R175H）通常发生于结合 DNA 的 L2-L3 motif，这些突变体在重新折叠以后不能组装出完整的 DNA 结合面，解释了为什么它们在满足 “Tm > Tambient”蛋白整体重新折叠以后仍难以被 TPF 策略恢复功能。ATO（及其类似物）是唯一研究了可适用 p53 突变体的广谱性恢复剂——ATO 在大规模生化实验、细胞实验、动物实验中，能够高效地复活 33 种突变体（往往是高温敏亚型的结构型突变体）、有效复活 357 种突变体（往往是低温敏亚型的结构型突变体）、不能复活 410 种突变体（往往是非结构型突变体，如 DNA 结合型突变体）。这一p53 突变体的清单，使得 ATO 临床试验能够根据患者是否携带这 33 种（或 357 种）可复活 p53 突变体来进行精准入组。不幸的是，过去几十年来，已有大量的广谱 p53 恢复剂被报道出来，但发现者从不研究这些恢复剂到底适用于哪些 p53 突变体。在基础研究中，研究者随意选择 p53 突变体，结果往往选择 R273H/C 这个发生频率最高的 DNA 结合型突变（而如上文所述，这种突变体是不可能被恢复功能的）；在临床试验中，所有广谱性 p53 恢复剂的临床试验（除 ATO 及其类似物的临床试验外）都不区分 p53 突变体地入组患者，尽管众所周知世界上并不存在“神奇”的可以恢复所有 p53 突变体功能的单一恢复剂。
主题四：4 项 p53 恢复剂有效性的评估标准
最近，我们在 10 项常用的 p53 实验系统中，制备了上万个不同的生物学样品，头对头比较了所有可获取的（指可以商业购买、或化学结构已经报道因此能够自行合成；比如 PC14586 就属于不可获取的恢复剂）的 p53 恢复剂。遗憾的是，我们发现除了 ATO 及其类似物外，所有 p53 恢复剂在所有 10 个实验系统中均检测不到任何 p53 功能恢复效果。因此，领域内亟需可靠且简便的标准来评估现有（以及将来出现）的 p53 恢复剂的有效性。在靶向治疗领域，用于评估新发现的靶向小分子的核心标准包括：具有可以解释 MoA 的结构学模型、具有符合结构模型的构效关系 SAR。但并不是所有细胞生物学实验室都具有这两项技术，为此我们提出了 4 项普通细胞生物学实验室都可以轻易测试的评估标准（图 A，第二个灰色框）。
第一项标准是采用确认有效的、敏感的 p53 活性分析实验系统，比如 p53 野生型样品的信号强度应是 p53 缺失和 p53 突变型样品的几百倍，如荧光素酶报告基因检测系统（luciferase reporter assay 这是分析转录因子转录活性的经典 assay）、p53 结构表位抗体 PAb1620 的免疫共沉淀实验（Co-IP）；PAb1620 只识别折叠状态下的p53）。2015 年决定投入 p53 恢复剂研究工作前，我花费了一整年时间，专门测试了所有已报道 p53 活性实验系统、所有 p53 恢复剂，发现有两个值得领域内注意的地方：1）领域内广泛使用 PAb1620 抗体免疫荧光 assay 来检测折叠状态下的 p53，但我们发现这个 assay 无法区分野生型 p53、p53 缺失和结构型 p53 突变样品，这可能是由于在细胞固定过程中折叠的 p53 不可避免地发生变性，导致不能被 PAb1620 抗体识别。2）温敏亚型的结构型突变体如 R282W 和 V272M 即使已经完全重新折叠（根据其完全恢复的转录活性、高于 37℃ 的 Tm 值推断），也不能被 PAb1620 抗体高效识别，这可能是由于 p53 的 DNA 结合域的拓扑结构效应所致。纵观文献中已经报道的各种 p53 恢复剂对 p53 转录活性和蛋白折叠的实验结果，发现文献中的恢复剂往往只能将 p53 突变体的转录活性或蛋白折叠提高 1-2 倍（注：往往需要提高上百、几百倍的提高，才可以达到野生型 p53 的水平；此外，很多实验系统的误差就有 1-2 倍），而 ATO 则往往可提高几十倍甚至几百倍的 p53 转录活性和蛋白折叠。
第二项标准是需加入野生型 p53 作为对照，这一简单的对照样品几十年来常常被忽视。加入这个对照样品有助于评估恢复剂离完全恢复 p53 功能还有多远。比如，尽管 ATO 上百倍地促进 p53-R175H 这一低温敏亚型结构型突变体的蛋白折叠，实现了蛋白折叠的完全恢复；但它仅仅 3-4 倍地提高 p53-R175H 的转录活性，远远不足以实现转录活性的完全恢复。
第三项标准是需加入一组功能恢复潜力明确的 p53 突变体作为内部对照。结构学机制以及大规模实验都表明，靶向蛋白折叠 TPF 策略对不同 p53 突变体的恢复效率是由突变体固有的突变特性预先决定的。TPF 策略曾有三次被大规模用于恢复上百种不同 p53 突变体功能的测试，包括低温下培养细胞、ATO 处理、PAT处理，实验结果都一致性表明各个 p53 突变体的恢复潜力的排名是固定的：高温敏亚型结构型突变体（如 V272M/R282W）> 非/低温敏亚型结构型突变体（如R175H/G245S/R249S）> 非结构型突变体（如 R273H/R248Q）（图C）。因此，如果现有的（以及将来的）某个 p53 恢复剂被报道可以恢复所有 p53 突变体的功能、或者恢复不同 p53 突变体的效率排名和上述不一致，那么它很可能并不直接靶向 p53 突变体，而是由 p53 突变引起的某些共同事件间接导致，比如 p21 下调或细胞氧化应激能力变化。
第四项标准是评估恢复剂对 p53 靶基因上调能力的时候，必须评估足够多的 p53 靶基因（理想情况是评估所有 p53 靶基因，如 RNA-seq），而非只评估或只展示少数几个靶基因。在 p53-null 的细胞系中导入野生型 p53，RNA-seq 结果表明 p53 的靶基因会被整体上调（亦即大多数而非仅仅一部分 p53 靶基因被上调），并且是特异性上调（亦即 p53 靶基因相比基因组中的其余基因被特异性上调）。因此，有效的 p53 恢复剂应该模拟野生型 p53，（和 ATO 一样）不仅整体地、还特异性地上调 p53 靶基因。很多 p53 靶基因是压力应激基因，他们可以在不依赖 p53 的情况下被化合物的细胞毒性所诱导上调。因此，以往文献中往往仅展示少数几个 p53 靶基因的上调，而不展示其余 p53 靶基因的表达（亦即没有确认 p53 靶基因是否属于整体上调）或基因组其余基因的表达（亦即没有确认 p53 靶基因属于否特异性上调），这不足以判断该恢复剂是否真能恢复 p53 的转录活性。
具我们所知，ATO 及其类似物是唯一同时满足以上 4 项评估标准的 p53 恢复剂，而其余所有已报道的 p53 恢复剂则不能满足以上任何一项标准。因此，最简单的判断一个新发现 p53 恢复剂有效性的方法是加入阳性对照和阴性对照——ATO 分别用于温敏亚型结构型突变体 V272M 和 DNA 结合型突变体 R273H 的功能恢复。
主题五：4 项 p53 恢复剂的临床试验规范
自 2009 年以来，p53 恢复剂已经进入了超过 20 项临床试验，涉及逾 1000 名患者，但迄今为止尚未发现任何统计学显著的患者获益。我们对所有大约 85 种已批准的靶向抗癌小分子进行逐个分析，总结出将实验室发现的靶向小分子推进至临床试验的 4 项研究规范：首先，需要具有可以解释 MoA 的结构学模型以明确其是一个靶向小分子；其次，SAR 与提出的结构学模型需相互兼容以确定结构学模型的正确性；第三，具备细胞内靶点特异性以确保其进入人体细胞后能结合靶蛋白；最后，需有明确的可适用突变体的清单以便进行精准患者入组。这 4 项临床规范在各种获批的靶向药物（都是癌蛋白抑制剂）、甚至野生型 p53 功能强化剂（如处于临床阶段的 MDM2 抑制剂）的临床转化中都得到严格遵守。然而，除 ATO 及其类似物以外，所有进入临床试验的 p53 恢复剂都未遵守任何一项以上规范（图 A，第三灰色框）。
此外，TP53 是基因组中的一个特殊基因，它高频突变于几乎所有癌症类型，因此，p53 恢复剂的临床试验还需考虑癌症类型。血液系统恶性肿瘤中 TP53 突变往往是一个关键的、甚至是唯一的癌症驱动突变——该突变与患者预后不良高度相关、复发患者 TP53 突变频率往往大幅升高、与 TP53 突变共发生的驱动突变较少——因此血液系统肿瘤是理想的 p53 恢复剂临床试验癌种。有趣的是，首次在人体内（First-in-human）实现 p53 突变体功能恢复（即上述提及的 p53 靶基因整体、特异性上调）就是利用 ATO 在血液系统肿瘤患者中取得的，这也是靶向治疗领域首次用小分子药物实现蛋白功能恢复，有望开启基于“蛋白功能恢复”而非“蛋白功能抑制”的疾病治疗模式。
主题六：研发 p53 恢复剂的经验教训
p53 恢复剂并不“神秘”，有效的 p53 恢复剂必然遵循上文所述的制药常识和科学逻辑。我们总结出以下经验教训：在药物筛选阶段，需选择有功能恢复潜力的 p53 突变体（如结构型突变体），并采用具有科学逻辑的功能恢复策略（如 TPF 策略）；在临床试验阶段，需选择合适的 p53 恢复剂（即满足上述 4 项有效评估标准和 4 项临床试验规范的恢复剂），并招募最可能有临床疗效的患者（如携带温敏亚型的结构型 p53 突变体的患者）。遗憾的是，据我们所知，目前仅有 ATO（和其类似物）满足上述 4 项有效性评估标准和 4 项临床试验规范，其余所有几十个广谱性 p53 恢复剂均不能满足上述任何一条有效性评估标准，也不能满足上述任何一条临床试验规范。
主题七：p53 靶向药物的前景
目前关于广谱性 p53 恢复剂有效性的报道很不一致，因此当前领域的一个重要任务应该是利用上述 4 项简单可靠的评估标准来评估现有（和未来）p53 恢复剂的有效性，并选择符合上述 4 项临床规范的恢复剂进行临床试验。尽管 ATO 符合所有这些评估标准和临床规范，但作为一种已获批的老药，其商业价值有限。因此，需要科学家、临床医生、制药公司之间更紧密的合作，以验证其在 TP53 突变癌症患者（尤其是血液系统肿瘤患者）中的疗效。
第二个任务是在 p53 上鉴定新的小分子结合口袋（见图 A，黄色框）。在癌症靶向治疗领域，蛋白的可成药性（druggability）在很大程度上取决于该蛋白是否含有深、窄、疏水的口袋，因为传统上只有这种口袋才能让小分子紧密结合。这一原则同样适用于 p53。p53-Y220C 上的 Cys220 口袋的发现，在过去几十年中极大地促进了众多 Y220C 单突变体特异性恢复剂的研究；然而，Cys220 口袋是 Y220C 突变体特有的，而癌症相关的 p53 突变体有超过 1000 种。2021 年我们团队发现的砷结合口袋（ABP）在几乎所有 p53 突变体中都存在，但由于该口袋空间较小，开发靶向 ABP 口袋的新型 p53 恢复剂具有较高挑战，一个例子是我们最近设计并进入工业界的肿瘤靶向性葡萄糖砷 AcGlcAs，但该化合物在本质上也通过释放一个砷原子发挥功能。因此，领域中的第二个任务是在 p53 中鉴定更多的小分子结合口袋，无论是变构口袋抑或是被掩埋因而难以被发现的口袋。逐个分析所有约 85 个已获批靶向抗癌小分子药物的结合口袋，我们发现这些口袋绝大多数都是蛋白质进化出来结合某个内源性配体的位点，例如大量已成药激酶中的 ATP 结合口袋、BCL-2 上的 BH3 结合表面、EZH2 中的 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸结合口袋、SMO 中的胆固醇转运通道、XPO1 中的核输出信号 NES 结合凹槽。在 p53 上鉴定小分子结合口袋极具挑战性，因为生物体很少进化出不用于结合内源性配体但又 druggable 的口袋（亦即可供小分子紧密结合的深、窄、疏水口袋）。但这并非不可能成功，一个先例是 KRAS 中的 SII-P 口袋的发现，它使科学家能够在短短 8 年内将 KRAS-G12C 抑制剂从实验室发现推进到临床获批。我们相信，本文提出的 p53 恢复剂研究规范，所涉及的7个主题（科学逻辑、领域误区、研发障碍、有效性评估标准、临床试验规范、经验教训、领域前景）可广泛适用于成药各种抑癌蛋白——癌症中最广泛存在但迄今无一成药的治疗靶点。
（A）p53 突变导致蛋白失去功能的多种机制（蓝色框）、研发 p53 恢复剂面临的 4 个障碍（粉色框），p53 恢复剂研究的经验教训和成药（黄色框）。下方灰色框依次列出 4 项领域内误区、恢复剂的有效性评估标准、将恢复剂推进至临床试验的规范。（B）胶连蛋白内部的多个氨基酸的作用力，促进了蛋白折叠。这些作用力包括自发生成的作用力如疏水相互作用、氢键、二硫键等等，也包括小分子与口袋结合时导入的作用力。（C）p53 靶向折叠策略 TPF 对不同结构型 p53 突变体具有不同的功能恢复效率的机制。在人体内，结构型 p53 突变体的 Tm 小于环境温度环境温度（37℃），因此处于非折叠状态（图 i）。当使用图示的三种 TPF 策略实现“Tm 大于环境温度Tambient”时，结构型突变体会重新折叠，要么重新折叠成和野生型完全一样的结构（子图 ii），要么还额外具有一个无序的 L3 环（子图 iii）。在子图 ii 中，高温敏型突变如 β-sandwich 突变、V272M、R282W 因为远离负责结合 DNA 的 L3 环，使得这些突变体在重新折叠时能重新组装出野生型的 L3 ，从而可以被 TPF 高效恢复功能；在子图 iii 中，非/低温敏型突变如 G245S 和 R249S 位于 L3 环并破坏了 L3 环，导致这些突变体在整体重新折叠后组装出无序的 L3 环，从而不能被高效恢复功能。
专家点评
谭蔚泓、吴芩 （中国科学院杭州医学研究所）
近期，卢敏课题组发表 Cancer Discovery，提出了 p53 恢复剂的科学逻辑和研究规范。目前，p53 恢复剂的主要研究方向是该课题组发现和改造的三氧化二砷 ATO、AcGlcAs、PAT 等砷化物和锑化物等。有意思的是，我国科学家还发现 ATO 也可以靶向急性早幼粒细胞白血病的致病蛋白PML-RARα 中的 PML，在联用全反式维甲酸 ATRA（亦即上海方案）时基本治愈了急性早幼粒细胞白血病，这可能是癌症治疗领域唯一明确被靶向药物治愈的癌症（临床治愈：患者结束治疗后，生存时间超过五年的概率超过 90%）。这提出了一个很有意思的问题：细胞内是否还有 ATO 结合靶点？
卢敏课题组近期发表在 J Med Chem 的论文详细研究了 ATO 靶向 p53 的构效关系 SAR，发现任何不含砷碳键的砷化物都可以在细胞内断开砷键并释放砷原子，进而结合 PML-RARα 和 p53 突变体。因此可以推断，ATO 的在细胞内的靶点将完全由砷原子的内在的化学性质决定。砷原子有四个有意思的化学性质：1）砷原子主要以三价存在，因此它高效地共价结合三个半胱氨酸（中的巯基），而对两个半胱氨酸和单个半胱氨酸的结合力非常弱。这个化学性质决定了砷的结合口袋需同时含有三个半胱氨酸。 2）发生共价化学反应的基础是物理上靠近，因此，这个口袋三个半胱氨酸的 alpha 碳相互之间的距离都必须在 7Å 左右（距离太远砷原子不足以同时和他们发生物理接触。3）这三个半胱氨酸的侧链都应该能够旋转至口袋内部。如果口袋中某一个半胱氨酸的侧链朝向口袋外部并和口袋外围氨基酸发生稳定的相互作用，那么该口袋没有结合砷原子的物理基础。4）砷原子和半胱氨酸巯基的结合是一种可逆、共价、亲和力中等的结合，因此，对于某些高亲和力结合锌原子的三半胱氨酸口袋，砷原子可能不能有效替换锌原子并结合该口袋。确实，卢敏课题组之前发表在 Cancer Cell 的论文表明，砷原子可以结合 p53 的 Cys124-Cys135-Cys141 口袋并复活 p53 突变体，但不结合同一个 p53 分子内的已被锌原子占据的 Cys176-Cys238-Cys242 口袋。根据上述四个条件，可以大体推断：除 PML 和 p53 外，细胞内可能只有少数蛋白能成为砷原子的靶点。ATO 的这种靶点特异性不同于那些携带半胱氨基结合 warhead（比如丙烯酰胺）的各种 p53 恢复剂，后者几乎不依赖 p53 蛋白上的任何结合口袋，而是直接结合 p53 蛋白表面的单个半胱氨酸，因此可以推断（并已经得到广泛证实）这些 p53 恢复剂将随机结合 p53 表面的各个半胱氨酸、任何表面携带半胱氨酸的蛋白，以及细胞内毫摩尔级别的含巯基的谷胱甘肽。
发现 ATO 的治疗靶点 PML-RARa 及其作用机制、设计双重靶向 PML-RARa 致病蛋白的 ATO 和 ATRA 协同靶向治疗方案、实现急性早幼粒细胞白血病的临床治愈，是我国对医学领域做出的重要贡献，这种“基础研究-转化研究-临床试验”的研究范式有望得到推广。在临床实践中，ATO 还显示出对急性早幼粒细胞白血病以外的癌种具有潜在治疗效果，但目前缓解率不高，而且缺乏统计学显著性，因此需要进一步确认其临床疗效。这些疗效可能与患者携带的 p53 突变有关，也有可能是由于存在 PML-RARa、p53 突变体以外未知的 ATO 结合靶点。因此，亟待基础科研工作者鉴定出更多的 ATO 治疗靶点，尽管细胞内的 ATO 靶点可能数量不多并且鉴定过程是一项艰巨的挑战，但由砷原子化学性质决定的对靶点的上述四项要求，将为靶点鉴定和验证带来极大便利；也亟待临床医生开展 ATO 对 p53 突变癌症患者的“老药新用”临床试验，尽管这类临床试验可能缺乏足够的商业价值，但却是一种可能快速造福我国癌症患者的药物开发策略。
