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图1 减数分裂过程。图片来源：bio.libretexts。
无融合生殖技术和反向育种技术（Reverse breeding，RB）都是通过降低或抑制重组频率固定杂种优势的技术。它们的不同点在于无融合生殖技术是在杂交种子上想办法，而反向育种技术则是在亲本上想办法。
关于无融合生殖技术，大家可以去看看伯小远之前写的文章“杂交作物如何通过自交获得克隆种子？”。通过无融合生殖能产生与母体基因组完全相同的后代，即实现母体的克隆，因而可以固定杂交优势，免去杂交制种的繁琐步骤，是具有革命性潜力的新型育种方式。目前无融合生殖技术的思路是把杂交种子的减数分裂转变为有丝分裂（例如敲除REC8、PAIR1和OSD1基因），再消除受精的合子中来自某一方亲本的染色体（例如与CENH3突变材料杂交，或敲除MTL或DMP等基因），或者直接让未受精的配子体进行孤雌生殖（例如过表达BBM或PAR或WUS基因）（图3）。目前在拟南芥和水稻中已经实现了无融合生殖技术(Marimuthu et al., 2011; Wang et al., 2019; Khanday et al., 2019; Song et al., 2024; Huang et al., 2024)。
2009年，荷兰瓦赫宁根大学Erik Wijnker团队在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了一篇题为“Reverse breeding: a novel breeding approach based on engineered meiosis”的研究论文，在该论文中，作者首次提出了反向育种的概念，并详细阐述了其原理、实现步骤、优势以及应用。
图5 反向育种可用于固定未知的杂合⼦(Dirks et al., 2009)。将两个纯合亲本杂交产生F1代，F1代自交产生F2代，选择其中具有理想性状的植株作为起始杂交种，并对其进行反向育种（灰色框）。通过抑制减数分裂重组，亲本染色体通过配子传递但不发生重排。图中杂交种的四条染色体在配子中可产生16种组合，这里只展示了5种，之后利用体外培养技术，使用无重组配子生产DHs系，选择互补亲本即可完美重建起始杂交种。
另外，作者也计算了在不同物种中，使用这种方法需要的DHs的数量（表1）。
上述方法的不足是，通过RNAi技术降低DMC1的表达导致染色体的交叉互换被完全抑制了，这正是预期的。但是，交叉互换可以使染色体之间建立物理上的联系，有助于同源染色体之间紧密连接形成二价体，确保它们在减数第一次分裂中被正确地拉向相反的两端，如果不发生交叉，同源染色体无法正确配对，染色体可能会分配不均，使生成的配子染色体数目异常，进而导致配子不育。正因如此，使用RNAi抑制DMC1表达的方法限制了其在作物上的进一步应用。另一种思路是减弱而不是完全抑制重组的发生，以提高配子的可育概率。
另外，反向育种若想从自交群体开始，那么上述的方法不可行，因为其需要在第一步向亲本中转入RNAi载体以抑制重组，而自交群体不一定能找到亲本。
反向育种技术需要结合分子标记技术以辅助筛选。2015年，南通大学李平团队在Journal of Integrative Agriculture杂志上发表了一篇题为“Development and application of marker-assisted reverse breeding using hybrid maize germplasm”的研究论文，作者利用分子标记从一个亲本信息未知的玉米起始杂交种筛选出了与相应父本和母本高度相似的材料。由于玉米种皮基因全部来自母本，而胚的基因一半来自母本、一半来自父本，分别获取起始杂交种种皮和胚的DNA，利用高密度芯片推导出双亲的基因型，再选择均匀分布于10条染色体的192个双亲间的多态性标记构建低密度芯片用于后续的辅助筛选。作者从F2代杂交种开始，经过三轮的标记辅助筛选F3、F4和F5代，获得了与亲本基因型有80%相同的品系（图12）。该研究使用的并非是前述Erik Wijnker提出的反向育种思路，因此小远在这里并未将其列入“实现玉米反向育种技术”之列，这里是提示大家可以在反向育种的实施路径中采用此方法以提高筛选效率。
图12 通过分子标记辅助反向育种开发的近交品系，其基因型和表型与杂交种的父母本相似(Yi-Xin G et al., 2015)。
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