文献导读|李洪林团队合作开发 PD-1通路新型抑制剂，SPIDER技术助力靶点鉴定

文摘 2024-08-28 08:12 上海

导语：在癌症治疗的不断探索中，免疫疗法以其独特的作用机制成为研究的热点。特别是在PD-1/PD-L1信号通路的调控上，新型药物的发现为患者带来了新的希望。本研究聚焦于一种名为Pygenic Acid A（PA）的天然五环三萜化合物，展示了其作为PD-1信号传导抑制剂的潜力。通过创新的SPIDER邻近标记技术，华东师范大学李洪林教授/华东理工大学朱丽丽副教授/上海交通大学陶生策教授/云南大学肖伟烈研究员合作团队不仅鉴定出PA的分子靶标SHP-2，还阐明了其独特的作用机制：通过占据SHP-2的磷酸化ITSM识别位点，PA有效阻断了PD-1与SHP-2的相互作用，从而促进了T细胞的免疫反应。这项研究不仅为癌症免疫治疗提供了一个有前景的新候选药物，也为小分子药物的开发和作用机制的理解提供了新的视角。

2024年8月，来自华东师范大学/华东理工大学/上海交通大学/云南大学的合作研究团队在SCIENCE CHINA Life Science（IF:8，1区）杂志上发表题为“Blocking the PD-1 signal transduction by occupying the phosphorylated ITSM recognition site of SHP-2 ”的研究，在本研究中，作者筛选了课题组内部化合物库，鉴定出天然五环三萜化合物Pygenic Acid A（PA）为一种PD-1信号通路新型抑制剂。利用SPIDER邻近标记技术联合LC/MS质谱分析鉴定出PA的分子靶标为SHP-2，PA通过靶向SHP-2，阻断PD-1与SHP-2的相互作用，有效增强了T细胞的免疫反应，并在小鼠体内显示出显著的抗肿瘤活性。

【发表期刊】SCIENCE CHINA Life Science

【发布时间】2024年8月

【影响因子】8.0

【核心技术】SPIDER

研究背景

程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和程序性死亡配体1 (PD-L1)是被证实的癌症靶点， PD-1和PD-L1抑制剂，如单克隆抗体，广泛应用于人类癌症。然而，从临床效果来看，抗PD-1和抗PD-L1的有效率仅为17%和13%，且存在给药方式不够便捷、费用高昂等问题。因此，急需寻找新的癌症治疗策略，如直接靶向胞内关键分子的小分子药物，对于癌症治疗具有重要意义。

本研究从天然资源中筛选并鉴定出具有PD-1信号抑制活性的新型小分子化合物Pygenic Acid A（PA），并深入探究PA的免疫调节功能，以及其作为PD-1信号传导抑制剂的潜力和作用机制，为癌症免疫治疗提供新的策略和药物候选。

研究路线

主要研究结果

结果一：天然小分子PA被鉴定为新型PD-1抑制剂。研究人员通过PD-1/PD-L1免疫检查点阻断细胞基础生物测定法筛选了天然化合物库，以寻找新的PD-1/PD-L1途径抑制剂(Fig.1 A&B)。实验结果表明，PA能够显著增加Jurkat-PD-1-NFAT细胞的荧光素酶表达，同时，也增加了IL-2的分泌，证实了PA可能通过阻断PD-1/PD-L1途径恢复了T细胞的激活状态(Fig.1C&D)。这些发现为PA作为PD-1信号通路抑制剂的潜力提供了初步证据。

接下来，研究人员评估了 PA在小鼠体内的抗肿瘤活性，研究表明，PA和Keytruda治疗组小鼠体内的肿瘤体积、重量明显小于对照组(Fig.1 E、F、G、H&I)，同时PA和Keytruda治疗组提高了肿瘤组织中CD8的表达量(Fig.1 J&K)，因此PA在hPD-1敲入 C57BL/6 小鼠中具有抗肿瘤活性，且该活性可能与CTLs的激活有关。

Fig.1 鉴定PA为PD-1/PD-L1抑制剂。

结果二：PA通过抑制PD-1信号转导来促进免疫反应。通过RNA测序分析，研究人员发现PA处理显著改变了与免疫激活相关的基因表达，特别是与干扰素信号通路相关的基因如STAT1、IFNG和IRF1的表达水平显著上调（Fig.2 A,B&C）。此外，通过qPCR和Western blot分析，研究人员验证了PA能够恢复PD-L1-Fc蛋白抑制下的Jurkat-PD-1-NFAT细胞中免疫炎症细胞因子的表达，并激活IFN/STAT1和MAPK/ERK信号通路（Fig.2 D&E）。该结果表明，PA通过阻断PD-1信号转导，增强了T细胞的免疫反应，为癌症免疫治疗提供了新的策略。

Fig.2 PA 通过抑制 PD-1 信号转导来促进免疫反应。

结果三：PA 通过抑制PD -1/PD-L1增强人T细胞的效应功能。研究人员从人外周血单核细胞（PBMC）中分离出T淋巴细胞，并建立了T细胞激活实验。实验结果表明，在PD-L1-Fc蛋白存在的情况下，CD3+ T细胞释放的IFN-γ和IL-2显著减少，而PA或Keytruda处理能够恢复这些细胞因子的分泌(Fig.3 A)。此外，PA剂量依赖性地恢复了被PD-L1-Fc蛋白抑制的CD4+和CD8+ T细胞的增殖(Fig.3 B)，并增加了细胞毒性T细胞中的颗粒酶B（GZMB）和穿孔素的表达(Fig.3 C)。通过测量乳酸脱氢酶（LDH）的释放，研究人员还发现PA或Keytruda能够增强活化的CTL对高表达PD-L1的癌细胞的细胞毒性(Fig.3 D)。这些发现表明PA通过抑制PD-1/PD-L1途径，有效逆转了T细胞的抑制状态，恢复了其细胞毒性。

Fig.3 PA 通过抑制 PD-1 信号传导增强人 T 细胞的效应功能

结果四：PA直接与PD-1下游信号分子SHP-2结合。PA发挥作用的机制是什么呢？封锁PD-1和PD-L1的结合(Fig.4 A)？下调PD-1或者PD-L1的表达量(Fig.4 B)？结果表明都不是。为了确定PA阻断PD-1信号传导的直接目标，研究人员使用SPIDER邻近标记技术联合LC/MS质谱分析，结果表明SHP-2与PA存在直接相互作用(Fig.4 C,D&E)，并通过DARTS实验(Fig.4 F&G)和表面等离子共振（SPR）(Fig.4 H)技术进一步确认。同时，PA与SHP-2的结合不抑制SHP-2的磷酸酶活性(Fig.4 I)，表明PA的作用机制与已知的SHP-2抑制剂不同。这些发现对于理解PA如何通过靶向SHP-2来阻断PD-1信号通路至关重要，并为开发新的免疫治疗策略提供了分子层面的见解。

Fig.4 PA靶向PD-1下游信号分子 SHP-2

结果五：PA占据SHP-2的磷酸化PD-1 ITSM识别位点。通过分子对接和动力学模拟，研究人员发现PA与SHP-2的C-SH2域中的特定氨基酸残基形成氢键和疏水相互作用(Fig.5 D)。此外，通过定点突变、竞争性ELISA以及Co-IP等实验，研究确认了PA能够阻断SHP-2与PD-1的磷酸化ITSM位点的结合，从而抑制SHP-2的招募(Fig.5 A,B,C,E&F)。这一发现表明PA通过一种新颖的作用模式来阻断PD-1信号通路，为开发针对PD-1/PD-L1信号的新药物提供了重要的分子机制见解(Fig.6)。

Fig.5 PA占据SHP-2的磷酸化PD-1 ITSM识别位点

Fig.6 PA抑制PD-1信号转导的作用机制示意图

参考文献

Li WJ, Mei WY, Jiang HW, et al. Blocking the PD-1 signal transduction by occupying the phosphorylated ITSM recognition site of SHP-2. Sci China Life Sci. 2024 Aug, ISSN 1674-7305.

SPIDER^TM技术源自上海交通大学科研团队开发的一项新型邻近标记技术（专利号ZL202110069353.7），该技术可应用于蛋白-蛋白、蛋白-核酸、蛋白-小分子等相互作用的筛选和发现。

SPIDER技术原理

在SPIDER 系统中，主要作用元件有三个部分：Streptavidin 与Pup^E融合表达蛋白（简称SA-Pup^E）、PafA、Biotin-Bait。其作用过程大致分为两步：

首先Biotin-Bait 与SA-PupE 结合导致Bait 与PupE 产生空间上的邻近；

其次，在PafA 的作用下，与Biotin-Bait 邻近的蛋白质的赖氨酸残基被共价连接上不同分子数的单体SA_m-Pup^E ，分子量增加约18 kDa。

由于Biotin 与Streptavidin 相互作用是目前自然界已知最强的非共价结合，并且能够耐受较为严苛的环境不会解离，如加热、8 M尿素洗脱等，因此在SPIDER 体系中，可以将Bait 与Prey 的结合模式认为类似于共价结合。

SPIDER技术原理示意图

SA_m:改造过的链霉亲和素；PafA:结核分枝杆菌类泛素化连接酶; Pup^E:改造过的结核分枝杆菌类泛素蛋白

选择SPIDER技术的优势

1、与传统检测Pull down技术相比，SPIDER技术将生物分子与互作蛋白以共价结合的方式牢固的连接在⼀起，洗脱时采用严苛条件降低非特异性结合蛋白干扰（如下图），结果更灵敏、更特异、更稳定。

2、与其他邻近标记技术相比，SPIDER技术应用范围广，任何可偶联biotin的生物分子均可检测，对于目前许多研究难点：如弱相互作用及瞬时相互作用蛋白、小分子靶蛋白、核酸相互作用蛋白等也适用。且可兼容完整细胞检测，特别适用于活细胞表面蛋白筛选。

SPIDER技术实验流程&准备

SPIDER技术检测流程

根据目标分子（即Bait）的不同，我们整理了相关实验的样本要求和实验方案，您可根据需求点击链接了解详情。

SPIDER应用案例 | SPIDER技术：活性小分子靶标鉴定

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上海抗码芯瑞生物科技有限公司（简称“抗码芯瑞”），由上海交通大学知名教授领衔创立，深耕蛋白组、抗体组领域研究超过20年。公司一直致力于抗体组学前沿技术方法的持续开发及成果转化，建立了国内领先的三大实验平台技术：以PhIP-seq/AbMap为支撑的抗体（组）研究平台、以新型邻近标记SPIDER技术为支撑的蛋白质靶点鉴定技术平台和以高通量筛选为特征的生物芯片平台，旨在推动更精准的疾病诊断、更高效的药物开发、更深入的生命科学研究。

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