文献导读|Nature : PhIP-seq技术用于儿童多系统炎症综合征与新冠病毒感染的关联机制研究

文摘 2024-09-02 08:33 中国台湾

导语：儿童多系统炎症综合征（MIS-C）与SARS-CoV-2感染密切相关，该病可导致机体多系统损伤，可认为是病毒感染后的严重后遗症。然而目前MIS-C的发病机制尚不清楚，且诊断标准过于宽泛，不利于有效治疗手段的确定。为此来自美国加州大学的研究团队运用PhIP-seq技术评估了MIS-C儿童（n=199）以及非MIS-C且曾感染过SARS-CoV-2的无症状或轻症儿童（n=45）的自身抗体反应谱。

2024年8月，来自美国加州大学的研究团队在Nature杂志上发表了关于儿童多系统炎症综合征（MIS-C）与SARS-CoV-2感染关联的病理机制研究。通过PhIP-seq技术，研究团队发现了机体内名为SNX8蛋白的一个表位与自身抗体发生了显著的靶向反应，由于新冠病毒核衣壳蛋白与SNX8蛋白的免疫原性区域具有显著的序列相似性，诱发机体产生了大量有交叉反应活性的效应T细胞，证明了MIS-C患者对SARS-CoV-2核衣壳蛋白产生了特征性自身免疫反应，这与自体蛋白SNX8的交叉反应相关，从而解释了病毒感染与炎症综合征之间的机制联系。

【发表期刊】Nature

【发布时间】2024年8月

【影响因子】50.5

【核心技术】PhIP-seq

研究背景

感染SARS-CoV-2病毒的儿童通常情况下症状较轻，但也可能发展为一种罕见且可能危及生命的后感染并发症，称为MIS-C。已报道有多种与MIS-C相关的自身抗体，且部分T细胞特征也与MIS-C的发展相关。在本文研究中，曾感染过SARS-CoV-2的，包括有MIS-C（n = 199）和无MIS-C（n = 45）的儿童血清样本，被用于评估其自身抗体对人蛋白质组和SARS-CoV-2蛋白组的反应活性，旨在为识别其他具有潜在病毒诱因的自身免疫和炎症性疾病（如川崎病、1型糖尿病和多发性硬化症）中的潜在交叉反应提供借鉴。

研究路线

主要研究结果

结果一：PhIP-seq技术筛选MIS-C患者特异性自身抗原。本研究纳入的MIS-C患者（n=199）和对照（n=45）例数均显著多于已有类似研究，选用的抗原库包含人全蛋白组和SARS-CoV-2全蛋白组（Fig. 1a）。通过分析PhIP-seq得到的差异肽结果，初步得到的特征肽有107种（Fig. 1b），通过ROC分析迭代得到的AUC=0.94（Fig. 1c），逻辑回归的结果显示来自ETS抑制因子类似物（ERFL）、分类素8（SNX8）和KDEL内质网蛋白保留受体1（KDELR1）编码序列的肽贡献最大（Fig. 1d）。为了避免假阳性结果影响后续分析，研究者采用Kolmogorov-Smirnov检验就行多重检验，在两组队列结果交集的35种肽中，有30种满足检验要求（Fig. 1e）。

Fig.1 MIS-C组与对照组自身抗体靶向的抗原有显著差异

结果二：MIS-C患者自身抗体靶向SNX8蛋白一特定表位。通过正交验证，PhIP-seq筛选出的三种蛋白ERFL、SNX8和KDELR1可以显著区分病患与对照。SNX8包含456个氨基酸，与宿主对RNA病毒的防御有关；ERFL是一种很少被关注的含354个氨基酸的蛋白质；KDELR1是一种含212个氨基酸的转运蛋白——这三种蛋白都预测为胞内蛋白，因此研究者推测存在着特异性识别产生上述蛋白的自身效应T细胞。由于SNX8在免疫细胞富集且在应对RNA病毒感染的MAVS通路调节种可能起作用（此通路与MIS-C病理有关），因此研究者选择对其进行进一步研究。

在本研究PhIP-seq文库中，完整的SNX8蛋白由19个重叠的49-mer肽表示，除一例患者外其余所有样本检测到的该蛋白富集肽段均位于25-73位氨基酸之间（Fig. 2a），通过丙氨酸扫描法确定最小免疫反应活性肽序列，确定确定了一个 9 个氨基酸的片段（位置 51-59：PSRMQMPQG）是免疫反应的关键区域（Fig. 2b）。

Fig.2 MIS-C组自身抗体显著靶向自体SNX8蛋白的一个特定表位。

结果三：MIS-C患者抗体优先靶向新冠病毒核衣壳蛋白。研究者评估了MIS-C患者和对照组对SARS-CoV-2感染的体液免疫差异，发现在SARS-CoV-2核衣壳蛋白中，三个近邻的肽（片段 5、8 和 9）显著富集，其中第一个肽（片段5，跨度为氨基酸 77-114）在对照中显著富集（代表儿童的典型血清学反应），而接下来的两个片段（片段 8 和 9，跨度为氨基酸134-190）在 MIS-C 患者中显著富集（Fig. 3a&b）。在 MIS-C 患者中，SARS-CoV-2 核衣壳蛋白中最具差异性反应的区域（片段 8）被称为 SARS-CoV-2 的MIS-C 相关域（MADS）。通过SLBA（split-luciferase-binding assay）对 16 个个体（包括 11 名 MIS-C 患者和 5 名对照）样本中 MADS 肽进行正交实验验证了PhIP-seq结果（Fig. 3c），并用三例患者样本精确定位了MIS-C 样本中 MADS 的最小免疫反应区域（Fig. 3d），SNX8 和 MADS 中鉴定出的关键区域高度相似，均由 (ML)Q(ML)PQG 模体表示（Fig. 3e）。

Fig.3 MIS-C组自身抗体靶向SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白区域

结果四：MIS-C患者自身T细胞对新冠病毒核衣壳蛋白存在交叉反应。在其他自身免疫性疾病中，最终破坏细胞的是效应T细胞。基于某些HLA（人白细胞抗原）与MIS-C相关，研究者推测MIS-C患者可能有靶向表达SNX8的细胞的效应T细胞。为了验证该假设，研究者将来自 9 名 MIS-C 患者（其中 8 名为SNX8 自身抗体阳性患者，1 名为 SNX8 自身抗体阴性患者）和 10 名对照（随机选择）的 T 细胞暴露于一个包含重叠 11 个氨基酸的 15-mer 肽库中，这些肽覆盖了完整的人类 SNX8 蛋白。T 细胞是否激活通过一个激活诱导标志物（AIM）检测进行表征，该检测量化三个细胞激活标志物的上调：OX40、CD69 和 CD137。结果MIS-C患者对 SNX8 蛋白的 T 细胞激活比例显著更高，9名MIS-C患者有7名结果为阳性，而10名对照皆为阴性（Fig. 4a）。接下来研究者目的是确定对SARS-CoV-2 MAD和宿主SNX8表位具有特异性的T细胞受体（TCR）序列，通过对4例样本的PBMC样本进行四聚体分选，鉴定了259个完整的TCR序列，构建了一个TCR相似性网络（Fig. 4b），其中两例样本直接在体外鉴定出了表达潜在交叉反应性TCR的独特的扩增性T细胞群体，而每位患者至少有一个体外潜在的交叉反应性TCR。为了确认四聚体分选中鉴定的TCR的特异性，研究者选择了8个TCR序列进行了独立验证，生成了稳定表达一个TCR的单独细胞系，这些Jurkat-TCR+细胞系经过四聚体染色，证实了三种Jurkat-TCR+细胞系（TCR 1, 7和8）的交叉反应性（Fig. 4c），在这些验证的交叉反应性TCR中，有两个是从MIS-C患者的体外PBMCs中获得的，包括TCR 7——该细胞群体具有克隆性扩增。仅TCR 7的最低体外频率为1/25000（在140035个循环CD8+ T细胞中有6个）。从体外分离获得的两个交叉反应性TCR来自同一样本，有相同的TRAV基因（TRAV1-2），具有相同的CDR3α序列，并且在TCRdist空间中与另外三个序列聚集，其中一个也具有克隆性扩增，这表明该患者有一大簇SNX8/MADS交叉反应性的CD8+ T细胞活跃扩增（Fig. 4d）。

Fig.4 MIS-C组SNX8自身反应性CD8+细胞对SARS-CoV-2 核衣壳蛋白具有交叉反应性

研究总结

这项工作基于PhIP-seq建立全景观的自身抗体谱和SARS-CoV-2抗体反应谱，并通过统计学分析和表位分析鉴定到一组交叉识别的模拟表位，发现了新冠病毒感染引发的MIS-C的机制，也为后续治疗提供了重要依据。微生物感染引发自身免疫是普遍且重要的疾病诱因，鉴定模拟表位是重要的科学问题。PhIP-seq技术可全面建立全景观抗体反应谱，并可进行表位相似性分析，因此在鉴定模拟表位中具有独特的技术优势。

参考文献

Bodansky, A., Mettelman, R.C., Sabatino, J.J. et al. Molecular mimicry in multisystem inflammatory syndrome in children. Nature 632, 622–629 (2024).

关于PhIP-seq技术

噬菌体免疫沉淀测序（Phage-immunoprecipitation sequencing, PhIP-seq）技术是一种高通量抗体谱检测技术，结合了高容量噬菌体展示多肽库、抗体免疫沉淀及高通量测序技术。该项技术可针对数十万种抗原进行血清抗体检测，全面绘制血清抗体谱，是免疫力相关研究的有力工具。

PhIP-seq技术原理

首先选择目标抗原数据库，利用生信分析将每个蛋白切分成连续的具有重叠区的肽段。然后根据肽段序列合成对应的DNA寡核苷酸，连接到载体上并包装成T7噬菌体展示多肽库，即多肽抗原库。当样本血清与多肽抗原库孵育后，通过Protein G/A的磁珠富集抗体特异性的噬菌体，后续将噬菌体DNA进行PCR扩增、建库及测序获得抗原多肽序列，通过分析即可得到血液抗体表位谱组成，进而实现对相关疾病抗体组成特征的解析。

六大噬菌体展示肽库

全国独家定制六大抗体组库，助力解析恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、致病菌感染、肠道菌群及过敏原抗体组谱组成。

PhIP-seq技术应用方向

疾病biomarker筛选、病因学研究、免疫力解码研究、疫苗疗效评估。

关于公司

上海抗码芯瑞生物科技有限公司（简称“抗码芯瑞”），由上海交通大学知名教授领衔创立，深耕蛋白组、抗体组领域研究超过20年。公司一直致力于抗体组学前沿技术方法的持续开发及成果转化，建立了国内领先的噬菌体免疫沉淀测序（PhIP-seq)技术平台，独家定制六大抗原组库，并可提供定制化抗原建库服务。抗码芯瑞开展基于PhIP-seq平台的高通量筛选、数据分析及后续验证等技术服务，为抗体组学研究提供整体解决方案。

联系我们

地址：上海市闵行区园美路58号1号楼702

电话：021-62202128，400-8868-750

邮箱：info@abcodebio.com

官网：www.abcodearray.com

关注我们

PhIP-seq交流群

PhIP-seq技术交流群

SPIDER交流群

SPIDER技术交流群

抗码生物

官方视频号，定期进行科研专题直播活动

抗码芯瑞

哔哩哔哩平台官方账号，讲述科研热点

同频的人总会相遇，点个“在看”和“赞”吧~

END

编辑 | 抗码芯瑞市场部

审核 | 抗码芯瑞市场部

抗码芯瑞

抗击疾病，解码生命