一、研究背景
1.JX 颗粒改善HF大鼠左心功能并抑制心脏纤维化
文章先从功能和病理入手，通过超声心动图评估左心室 （LV） 功能，通过组织学分析检查 LV 纤维化。
通过结扎大鼠左前降诱导支心肌梗死发作。梗死后1周通过超声心动图评估左心室功能，将左心室射血分数低于50%的大鼠纳入后续研究，大鼠被随机分配到模型组、假手术组、JX颗粒组和沙库巴曲/缬沙坦（S/V）组，其中假手术组作为阴性对照。
与对照组相比，模型组大鼠室间隔回声增强，室间隔（interventricular septum，IVS）增厚减少。JX颗粒或S/V处理增强了IVS运动幅度。对照组（假手术组）大鼠心肌细胞形态规则，排列有序，未见水肿（图D）。
模型大鼠表现为心肌细胞排列紊乱、心肌细胞肥大或坏死、间质水肿、胶原纤维增生。然而，与模型组相比，JX颗粒组和S/V组大鼠表现出更有序的心肌细胞排列。此外，与对照组相比，模型组的左心室心肌表现出胶原纤维增加（蓝色）。JX颗粒或S/V处理显著减轻了纤维化。
图1.JX颗粒对HF大鼠左心室组织病理学的影响
2.JX颗粒改善HF大鼠线粒体损伤并改善氧化应激
众所周知，缺氧时，线粒体的氧化磷酸化受阻，ATP生成减少，嵴结构破坏时，氧化磷酸化效率进一步下降。线粒体水肿也是细胞缺氧损伤的一种表现，细胞通过无氧糖酵解维持能量供应，但长期缺氧可能导致细胞损伤或死亡。
为了阐明 JX 颗粒对线粒体功能的影响，研究人员分析了心肌中的线粒体形态、氧化应激和ATP 水平，通过比色测定法评估三磷酸腺苷（ATP）、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）活性和活性氧（ROS）。
透射电子显微镜显示，对照组线粒体嵴清晰，几乎没有发生线粒体空泡化。在模型组中，线粒体表现为肿胀、稀疏嵴无序、骨折和空泡。JX颗粒组和S/V组线粒体略微肿胀，空泡较少，线粒体嵴更明显。JX颗粒组和S/V组线粒体的结构功能良好。
HF大鼠ROS和MDA浓度增加，荧光强度增加证明。同时，抗氧化能力（T-AOC）显著降低。JX颗粒和S/V部分逆转了氧化应激的变化。与对照大鼠相比，模型大鼠 LV 心肌中 ATP 水平降低。
图2.JX 颗粒改善 HF 大鼠线粒体损伤并改善氧化应激
3.JX 颗粒抑制 HF 大鼠细胞凋亡
研究人员对大鼠的心肌细胞进行凋亡测定，在对照大鼠中，心肌核被染成蓝色（正常核）。并且几乎没有观察到棕黄色的细胞核（凋亡细胞核）。与对照组相比，模型组凋亡细胞的百分比显著增加，JX颗粒或S/V处理的凋亡细胞与模型组相反。
研究人员又使用Western blot测定以检查细胞凋亡相关分子。模型大鼠裂解的 Caspase-9/Caspase-9、裂解的Caspase-3/Caspase-3和Bax的表达升高，但使用JX颗粒或 S/V处理后都部分逆转。相反，Bcl-2的表达在HF大鼠中受到抑制，但在用JX颗粒或S/V处理后表现出增加。
图3.JX 颗粒对 HF 大鼠细胞凋亡的影响
4.JX 颗粒对 HF 大鼠差异表达蛋白的影响
提取差异表达蛋白（DEPs）的核心价值可用于揭示药物作用机制。结合GO和KEGG富集分析，可以更深入地理解DEPs的生物学意义，为后续研究提供重要线索。
通过Tandem Mass Tags方法获得差异表达蛋白（differential expressed proteins ，DEP）。与对照组相比，在模型大鼠中鉴定出150个DEP，包括112个上调和38个下调的蛋白质。值得注意的是，在 JX 颗粒组中，与模型大鼠相比，鉴定出 25 个 DEP，包括 18 种上调和 7 种下调蛋白。与对照组相比，JX 颗粒组获得 228 个 DEP，由 128 个上调和 100 个下调蛋白组成。所有 DEPs 数据都用火山图和热图表示（图 D）。
探索了生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）成分的GO富集分析，以及KEGG富集途径。与对照组相比，模型组BP主要富集于体液免疫反应、凋亡细胞清除的正调控和对金属离子的反应;同时，CC主要与收缩和应力纤维、肌动蛋白丝和细胞外间隙有关;MF主要富集丝氨酸型肽酶活性、肌动蛋白结合和肽酶活性。此外，KEGG分析指示的DEP主要与补体和凝血级联反应、肌动蛋白细胞骨架调节和肾上腺素能信号传导等途径有关。对照组和模型组之间的比较 KEGG 通路分析表明，DEP主要富集于半乳糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢以及色氨酸代谢。同样，将模型组与JX颗粒组进行比较的分析突出了半乳糖代谢、溶酶体、氨基糖和核苷酸糖代谢等途径的显著富集。相比之下，对照组和JX颗粒组的比较显示心肌细胞补体和凝血级联反应、心肌收缩和肾上腺素能信号传导的富集。KEGG分析确定了对照组/模型组和模型/JX 颗粒组普遍受影响的几种通路，包括半乳糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、色氨酸代谢、碳代谢、淀粉和蔗糖代谢、PPAR 信号通路、丙酮酸代谢、HIF-1α 信号传导和 PI3K-Akt 通路。
图4.JX 颗粒对 HF 大鼠差异表达蛋白的影响
图5.JX 颗粒对信号通路的影响
5.JX 颗粒对 HF 大鼠差异代谢物的影响
通过比较JX颗粒组与模型组的差异代谢物，可以揭示JX颗粒如何调节代谢通路以改善HF。
为进一步探索JX颗粒对HF大鼠代谢过程的影响，检测心肌组织中的差异代谢物。包括3D-PCA分析在内的多方面方法。PCA分析、PLS-DA 用于辨别数据集中负电离和正电离模式的不同聚类模式。在使用KEGG数据库基于差异代谢物的代谢途径分析之后。在正离子模式下鉴定的前5条代谢途径是逆行内源性大麻素信号传导、辅因子的生物合成、坏死性凋亡、β-丙氨酸代谢以及泛酸盐和coa生物合成。在负离子模式下，关键的代谢途径包括HIF-1信号通路、磷酸戊糖通路、丙酮酸代谢、泛酸和coa生物合成以及嘧啶代谢。通过LC-MS/MS处理分析的差异代谢物在各组之间显示出统计学差异。热图分析分别鉴定了111种和48种正离子和负离子模式的差异代谢物。
图6.JX颗粒对HF大鼠差异代谢物的影响
6.HF大鼠蛋白质组学和代谢组学的综合分析
综合分析显著差异的蛋白质和代谢物，结合KEGG通路和网络分析，揭示了JX颗粒通过调控代谢途径和信号通路来改善HF的分子机制。
为了阐明显着不同的蛋白质和代谢物之间的关系，进行了综合分析。这些关键的差异基因包括磷酸丙糖异构酶 1 （TPI1）、乳酸脱氢酶 B （LDHB）、丙酮酸激酶 M （PKM）、Akt、乳酸脱氢酶 A （LDHA）、类固醇受体共激活因子 （SRC）、丙酮酸脱氢酶 β （PDHB） 等。建议KEGG通路共调控特征的蛋白主要参与代谢途径、碳代谢、液体剪切应力和动脉粥样硬化、PI3K-Akt 信号通路、胰高血糖素信号通路、丙酮酸代谢、HIF-1α 信号通路等。
为了进一步阐明通路和枢纽基因之间的相互作用，进行了通路网络分析。绿色方块代表通路，而黄色圆圈表示参与网络的目标基因。该分析表明了JX颗粒对HF影响的关键关系。
图7.通过蛋白质组学和代谢组学的综合分析，JX 颗粒对枢纽基因和关键调控途径的影响
7.JX 颗粒改善丙酮酸代谢以及PI3K和HIF-1α信号通路
通过KEGG通路分析确定HF大鼠受JX颗粒影响的关键靶点包括PDHB、PKM、Akt、 LDHA和HIF-1α。这表明 JX 颗粒可能与PI3K/Akt和HIF-1α信号通路一起调节丙酮酸代谢通路。
图8.JX 颗粒对p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、PDHB、LDHA和PKM2蛋白表达的影响
8.JX 颗粒通过增强h9c2细胞的akt活性和减少细胞凋亡来增加ATP的产生（正反验证）
为了进一步证实JX颗粒可以通过PI3K-Akt通路抑制氧化应激和细胞凋亡，使用特异性 PI3K 抑制剂（LY294002）阻断该通路。将H9c2细胞与Ang II一起孵育。然后测定ROS 水平、细胞凋亡指数、p-Akt 和 ATP 水平， Ang II刺激显着增加了H9c2 细胞的 ROS 荧光强度和凋亡指数，而JX颗粒则显著减弱了这种荧光强度和凋亡指数。进一步的 LY294002治疗部分阻止了ROS和细胞凋亡的减少。Western blot分析表明，与空白对照相比，Ang II孵育的细胞中Akt的活性显著降低了47%。JX颗粒处理使其活性显著提高了 2.5 倍，可通过LY294002共处理部分逆转。然而，在没有Ang II的情况下，JX对p-Akt活性没有影响。与Ang II孵育组的H9c2细胞中ATP水平低于空白对照细胞。用JX颗粒处理后，ATP水平显着升高。与 Ang II + JX颗粒组相比，进一步的 LY294002 处理显着减弱了ATP的产生。JX 颗粒在未进行Ang II孵育的细胞中略微增加 ATP。
近年来，国家自然科学基金对中医药研究的支持力度持续增强，中医药领域也因此受到越来越多学者的广泛关注。心力衰竭作为一种主要的临床综合征，其患病率和死亡率均居高不下，亟待深入研究。在本研究中，研究人员综合运用蛋白质组学、代谢组学以及体内外实验，系统探讨了JX颗粒对心力衰竭的治疗作用及其潜在机制。研究聚焦于氧化应激、丙酮酸代谢相关蛋白以及PI3K/Akt介导的细胞凋亡通路。研究结果表明，JX颗粒能够显著改善心力衰竭大鼠的左心室功能，并有效减少细胞凋亡，其效果与沙库巴曲缬沙坦（S/V）相当。进一步机制研究发现，JX颗粒可能通过调节氧化应激、线粒体功能和丙酮酸代谢相关蛋白的表达，促进ATP生成，并通过激活PI3K/Akt通路抑制细胞凋亡。本研究为JX颗粒治疗HF的疗效和机制提供了重要的理论依据，也为中医药在心力衰竭治疗中的应用奠定了科学基础，为HF患者提供更多治疗选择。
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