Hello，大家好，小编为大家带来一篇最近刚发表在cell上的文章《YTHDF2 promotes ATP synthesis and immune evasion in B cell malignancies》。这篇文章对多个队列的B细胞恶性肿瘤进行单细胞、转录组的分析，同时应用了CHIP、CRISPR等技术研究基因功能，确定了YTHDF2在B细胞恶性肿瘤中能够促进能量供应和抗原逃逸，且过表达能够导致肿瘤的发生，发现了小分子介导的YTHDF2靶向抑制侵袭性B细胞信号，总结其对CAR-T治疗敏感。
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图1 文章机制总结图
整合实验、单细胞与转录组研究基因突变对性状以及疾病发展的影响
蛋白基因组学研究转录组与蛋白组学中存在的一致性
构建了实验网络以研究疾病基因的互作关系
低嵌合抗原受体（CAR）-Tcell免疫治疗对母细胞恶性肿瘤的长期持久缓解仍不令人满意，通常是由于抗原逃逸。恶性B细胞转化和致癌生长依赖于有效的ATP合成，尽管其潜在机制仍未揭秘。在这里，我们报道了YTHDF2在B细胞恶性肿瘤中促进能量供应和抗原逃逸，并且仅其过表达就足以引起B细胞转化和肿瘤发生。在机制上，YTHDF2的功能是双结合，它通过招募PABPC1来稳定mRNA中5-甲基胞嘧啶（m5C）结合，从而增强它们的表达和ATP合成。同时，YTHDF2也通过作为6-甲基腺苷（m6A）结合位点破坏其他mRNA的稳定来促进免疫逃避。小分子介导的YTHDF2靶向抑制侵袭性B细胞信号，并使其对CAR-Tcell治疗敏感。
1.在超过2000名患有B细胞疾病的患者中进行转录组检测与分析，发现m6A机制相关的显著基因中，YTHDF2全部一致且显著地过表达。使用超过1100个B细胞相关肿瘤的CRISPR敲除癌症细胞系数据进行分析，发现YTHDF2对B细胞白血病和淋巴瘤的细胞生存情况影响远高于其他癌症的细胞系数据。值得注意的是，在疾病患者中，即使是正常的GCB细胞，也存在明显的过量表达，且该特征在预后中也存在较强的关联。
除了转录组之外，YTHDF2的对应蛋白在患者中同样存在极高的表达，且该表达明显展现出了致癌的倾向。为了验证该结果，通过CRISPR对小鼠进行敲除实验，发现敲除后显著抑制了B淋巴母细胞白血病中B细胞的增殖和恶化，而未做敲除实验的小鼠B细胞则表现出明显的环境适应性，证明YTHDF2确实与B细胞疾病的恶化和增殖相关。
2.之后的研究中，发现在复发的B淋巴母细胞白血病异种移植物中敲除YTHDF2，能够显著抑制移植物的发展，延缓了疾病的发生。即使是复发型的B淋巴母细胞白血病的B细胞，在YTHDF2缺失后同样失去了发展为B淋巴母细胞白血病的能力，说明YTHDF2可能影响肿瘤微环境。使用单细胞分析后发现，敲除YTHDF2后T细胞数量显著增加，YTHDF2的过表达能够使单个B细胞转化为多个B细胞的集合，且形成能力逐步增加。原发性骨髓移植的小鼠能够发生B淋巴母细胞白血病，且侵蚀性较强，而缺失m6A结合能力的YTHDF2突变体依旧具有致病的能力，只是潜伏期较长、起始速度较慢，说明YTHDF2致癌的机制并不仅依靠于m6A。
3.通过对cBioPortal数据库的分析，发现YTHDF2在淋巴细胞肿瘤中的突变频率非常低。随后对于YTHDF2启动子附近区域的研究发现，知名的致癌转录因子如MYC、STAT3和POU2AF1，在恶性B细胞的YTHDF2启动子区域显著活跃，而在正常的B细胞当中几乎不表达。在肺恶性细胞中进行TFs敲除实验，发现YTHDF2的表达在24小时候显著降低。在患者的正常活跃B细胞中，YTHDF2的表达与MYC和POU2AF1的表达展现出正相关。而弥漫性大B细胞瘤中，也同样证明了这些TFs的致癌作用与YTHDF2相关。
4.使用转录组分析以研究m6A是否参与致癌调控的过程，首先使用KEGG富集分析，对1379个非m6A修饰的基因进行分析，发现在线粒体中传递电子并最终导致形成ATP的ATPase基因富集最多。此外，在B淋巴母细胞白血病和弥漫性大B淋巴瘤中，许多与ATP合成相关的途径均有明显的高富集，即使弥漫性大B淋巴瘤进行了YTHDF2敲除，仍旧在细胞周期上有非常显著的富集，因此研究认为YTHDF2在B细胞恶性肿瘤中促进了线粒体的氧化磷酸化。
在恶性B细胞中的脂肪代谢分析也有新的发现，对YTHDF2进行敲除重编程，发现ATP的合成/丰度显著减少，OXPHOA和TCA在m6A下调的转录本中显著表达，在除急性髓系白血病的恶性B细胞肿瘤和其他肿瘤中，YTHDF2的敲除会导致呼吸碱性和加氧量减少、ATP的合成/丰度减少，而在正常B细胞中，YTHDF2的过表达情况正好相反。发现ATP5PB、ATP5MF、ATP5MG是YTHDF2缺失中最显著下调的ATPase基因。研究发现公开数据库中骨髓样本和收集的细胞样本中，YTHDF2和靶基因的mRNA丰度显著正相关。且这些靶基因的敲除显著抑制了白血病的发生，并使生存时间得到了延长，这三个靶基因的过表达可以完全改善YTHDF2敲除引发的ATP合成/丰度、细胞生长/增殖和氧吸收的减少。由此表明，YTHDF2增强了ATP活性和细胞代谢，促进了非m6A修饰靶基因ATP5PB、ATP5MF、ATP5MG的表达。
图4 YTHDF2在不同细胞中的表达分布相关图
5.为了进一步研究YTHDF2促进ATP合成/代谢的非m6A依赖性机制，研究构建使用了YTHDF2的多种突变、同义替换等变异，认为YTHDF2不仅依赖m6A的结合能力，同时还依赖其他类型RNA修饰的结合能力，并为此使用RNA免疫沉淀技术以及高效液相色谱和质谱法进行验证。
结果发现，YTHDF2突变后的结合能力，与阻断m6A修饰或阻断RNA结合的结合能力相当，因此证明YTHDF2-m6A-MUT的部分表型来源于非m6A的依赖性活性。
此外还发现，阻断m6A的YTHDF2修饰中，m5C的结合能力会显著降低，由此说明，YTHDF2不仅与m6A修饰具有很强的结合能力，与m5C同样具有较强的结合能力。根据m5C-MeRIP-seq以及亚硫酸氢盐转化的RNA-seq，对mRNA进行鉴定，发现YTHDF2敲除的B淋巴母细胞白血病中，有816个非m6A修饰的下调基因，其中539个能够与野生型中的YTHDF2结合，439个能够被m5C标记，且在代谢途径中显著富集。对结合位点的重叠区域进行荧光定量PCR，发现恶性B细胞中YTHDF2的敲除使ATP5PB、ATP5MF、ATP5MG、细胞生长和加氧消耗显著降低。
其他文献中也曾提到，PABPC1通过与m5C开放框蛋白相互作用能够稳定m5C的转录本，这对YTHDF2也同样适用，在B细胞恶性肿瘤患者的研究中发现，PABPC1的表达与YTHDF2或靶基因的表达显著正相关，且原代细胞系中PABPC1的mRNA和蛋白水平远高于健康组。此外，较高水平的PABPC1表达也与较短的生存时间等相关，小鼠的实验证明了YTHDF2与PABPC1具有直接相互作用。
图5 YTHDF2 变异和结合机制统计学及实验结果
总而言之，在本研究中，研究者分析了多种B细胞恶性肿瘤疾病的细胞系、小鼠模型的单细胞、转录组和蛋白组数据，发现YTHDF2通过促进ATP在B细胞恶性肿瘤中的供能发挥强大的致癌作用，且该作用能够促进细胞生长、不良预后的发生和生存期的缩短。此外，YTHDF2在m6A修饰和m5C修饰共用同一开放框，但结合时使用的氨基酸略有不同，并且能够促使肿瘤发生免疫逃逸，因此单一修饰并不能遏制肿瘤的发展。此外，YTHDF2的缺失能够导致造血干细胞和CD4+ T细胞的扩增，不影响B细胞的正常生长发育，但可强烈遏制恶性B细胞的存活/生长。
最后，感兴趣的小伙伴可以通过参考文献查看该研究的完整原文，如果你在课题研究中偶然发现了新靶点不知道该怎么验证，或者不知道该靶点能否成为临床治疗指标，不妨使用该文章的思路进行验证。
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参考文献：
Chen Z, Zeng C, Yang L, Che Y, Chen M, Sau L, Wang B, Zhou K, Chen Y, Qing Y, Shen C, Zhang T, Wunderlich M, Wu D, Li W, Wang K, Leung K, Sun M, Tang T, He X, Zhang L, Swaminathan S, Mulloy JC, Müschen M, Huang H, Weng H, Xiao G, Deng X, Chen J. YTHDF2 promotes ATP synthesis and immune evasion in B cell malignancies. Cell. 2024 Dec 12:S0092-8674(24)01324-2. doi: 10.1016/j.cell.2024.11.007. Epub ahead of print. PMID: 39694037.
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