来源：Biosyn世纪
论文研究目标及产业意义
本论文在2024年10月8日加速在线发表于Nature。研究目标是开发一种新型的光酶催化的氢胺化反应,用于不对称合成具有挑战性的α-叔胺化合物。这类化合物广泛存在于小分子药物和农用化学品中,传统合成方法存在区域选择性和对映选择性难以控制等局限性。论文希望通过蛋白质工程改造拜耳-维利格单加氧酶,实现高效、高选择性的分子内烯烃氢胺化反应,为这类重要化合物提供一条全新的合成途径。
C–N bond formation is integral to modern chemical synthesis due to the ubiquity of nitrogen heterocycles in small-molecule pharmaceuticals and agrochemicals. Alkene hydroamination with unactivated alkenes is an atom economical strategy for constructing these bonds. However, these reactions are challenging to render asymmetric when preparing fully substituted carbon stereocenters.
这一研究解决的问题对医药和农药等多个产业的发展具有重要意义。开发高效、高选择性的α-叔胺合成方法,有助于加速药物分子和农药活性成分的研发和生产,降低成本,推动相关产业的进步。同时,这项研究也为生物酶催化剂在精细化学品合成中的应用提供了新的思路和范例。
论文的创新思路和研究方法
本论文提出利用蛋白质工程改造环己酮单加氧酶,实现分子内烯烃的不对称氢胺化反应。与传统的过渡金属催化剂和布朗斯特酸催化剂相比,酶催化剂具有高效、高选择性和环境友好等优势。论文通过五轮定向进化和位点饱和突变,将野生型 AcCHMO 酶改造成高活性的 AcHYAM 突变体,实现了高达97%产率和95:5 e.r.的优异结果。
Five rounds of protein engineering afforded a mutant, providing excellent product yield and stereoselectivity.
此外,论文基于实验结果,提出了一种酶催化氢胺化反应的新机制。有别于已知的自由基阳离子历程,该机制涉及还原态黄素辅因子 FADH 对烯烃底物的单电子还原,继而经由自由基中间体与胺氮原子的瞬时成键实现C-N键的构建。作者通过密度泛函理论(DFT)计算和分子动力学模拟证实了这一新颖的"涌现机制"。
Unlike related photochemical hydroaminations, which rely on the oxidation of the amine or alkene for C–N bond formation, this work exploits a through-space interaction of a reductively generated benzylic radical and the nitrogen lone pair. This antibonding interaction lowers the oxidation potential of the radical, enabling electron transfer to the flavin cofactor. Experiments indicate that the enzyme microenvironment is essential in enabling a novel C–N bond formation mechanism with no parallel in small molecule catalysis.
一、酶定向进化实现高效不对称氢胺化反应
作者通过五轮蛋白质工程,将环己酮单加氧酶AcCHMO改造成突变型AcHYAM,将模型反应的产率从12%提高到97%,对映选择性从55:45 e.r.提升到95:5 e.r.。这一发现突破了酶催化剂在不对称氢胺化反应中的活性和选择性瓶颈,实现了具有挑战性的α-叔胺化合物的高效合成。
Five rounds of protein engineering afforded a mutant, providing excellent product yield and stereoselectivity. (Figure 2)
图2. 蛋白质工程历程及关键突变位点
二、拓展底物适用范围,实现药物活性分子的不对称合成
在20多个不同取代底物的拓展实验中,突变型AcHYAM表现出优异的催化活性和选择性,电子富集的芳环底物普遍取得了更高的产率(60-99%)和对映选择性(最高98:2 e.r.)。该方法成功应用于GNF-8625、Larotrectinib等重要药物分子的关键片段的不对称合成,展现了其在药物合成领域的应用前景。
Electron-rich arenes generally affording higher yields and selectivity (2; 4–10, 13–20). The cyclization was sensitive to the heterocyclic substitution and severely hampered in some cases (Supplemental Figure S1). Nevertheless, protein engineering might allow to overcome these limitations. (Figure 3)
图3. 光酶催化氢胺化反应的底物适用范围
三、揭示酶促自由基历程,发现新型C-N键形成机制
通过光还原预处理、碳正离子探针等一系列机理研究实验,作者排除了胺自由基阳离子和能量转移等可能历程,支持了自由基历程。密度泛函理论(DFT)计算表明,酶活性口袋诱导底物形成预组织构象,使得苄基自由基的SOMO轨道与胺基的孤对电子轨道产生成键相互作用,降低了自由基的氧化电位,从而利于其被黄素辅因子FADsq-氧化淬灭,促进C-N键生成。这一发现揭示了一种独特的酶促C-N键形成的"涌现机制",为酶催化剂的理性设计提供了新思路。
Experiments indicate that the enzyme microenvironment is essential in enabling a novel C–N bond formation mechanism with no parallel in small molecule catalysis. (Figure 4)
DFT calculations of the preorganized form in MeCN. Frontier molecular orbitals and energies were calculated at M06-D3(0)/6-311+G(d,p) level of theory. Redox potentials were determined using the Born-Haber relation. (Figure 4d)
图4. 机理探究及涌现机制揭示(左上:催化循环; 左下:静电势图; 右:DFT计算)
四、阐明蛋白质微环境对反应选择性的调控作用
分子动力学模拟研究揭示了突变体AcHYAM较野生型酶能为底物提供更大的构象自由度,使其更易达到有利于C-N键形成的预组织态。这说明酶的微环境对反应选择性和区域选择性起着关键调控作用。相比之下,游离的光催化剂如10-苯基吩噻嗪虽然能还原模型底物1的烯烃部分,但并未检测到任何环化产物。这进一步印证了蛋白质构象诱导对实现高效、高选择性氢胺化反应的重要性。
MD simulations suggest that the AcHYAM environment provides the model substrate with more rotational freedom relative to the parent enzyme. However, we see evidence of substrate conformations in AcHYAM that resemble the preorganized conformation investigated by DFT (Figure 5a), which are sparsely observed in the parent enzyme.
图5. 分子动力学模拟揭示的酶微环境诱导的底物预组织态(a)及游离光催化剂的对照实验结果(b)
本文基于蛋白质工程和理论计算相结合的策略,开发了一种高效、高选择性的酶催化不对称氢胺化新方法,并揭示了一种独特的酶促C-N键形成的"涌现机制",为手性α-叔胺等重要化合物的绿色合成提供了新思路。这项工作展现了定向进化在开发新型生物催化剂方面的巨大潜力,有望加速药物分子等精细化学品的绿色制造进程。
研究成果的学术和产业影响
本论文的研究成果在学术和产业界都具有重要影响:
开发了一种新型的酶催化合成策略,为具有重要应用价值的手性α-叔胺化合物提供了高效、高选择性、环境友好的制备方法。这将加速相关药物分子和农药活性成分的开发和生产。
发现了一种全新的酶促C-N键形成机制。这种基于瞬时成键相互作用调控氧化还原电位的"涌现机制"为酶催化剂的理性设计提供了新思路。
展示了蛋白质工程在开发新型生物催化剂方面的潜力。通过定向进化等手段,可将天然酶的活性提高数倍乃至数个数量级,并赋予其全新的催化功能。这将大大拓展生物酶在精细化学品合成等领域的应用,催生出新的技术创新和商业机会。
论文中开发的光酶催化氢胺化反应在流程化学中具有良好的应用前景。与传统的化学催化剂相比,酶催化剂具有高效、高选择性、环境友好等优势。将其与光催化和流动化学技术相结合,有望实现关键药物分子、天然产物、功能材料等的绿色可持续合成。
未来研究方向及投资前景
基于本论文的研究成果,未来在以下几个方面值得进一步探索:
扩大酶催化氢胺化反应的底物适用范围,如发展分子间反应、三级胺的不对称合成等,进一步提高其应用价值。这需要对酶的活性口袋进行更精准的改造。
深入研究涌现机制的本质,阐明蛋白质微环境在调控自由基反应性方面的作用机制,为后续酶催化剂的定向设计提供理论指导。特别是利用机器学习等手段,加速对最优氨基酸位点组合的搜索和鉴定。
开发新型光酶催化体系,拓展酶促自由基化学在C-C、C-O、C-S等键形成反应中的应用。重点优化辅酶再生和光敏化过程,提高催化效率和光能利用率。
探索光酶催化与流动化学、生物合成等技术的耦合,发展绿色可持续的化学品合成新路线。重点关注关键药物分子、天然产物、功能材料、农用化学品等具有显著应用价值的化合物。
Critical Thinking
开发的酶催化体系对底物的普适性有待进一步拓展。目前主要集中在内苯胺和苯乙烯类化合物,对含杂环胺类底物的适用性较差。如何通过蛋白质工程进一步拓宽底物适用范围,是后续研究需要重点解决的问题。
对于涌现机制的解释还主要停留在理论验证阶段,有待更直接的实验证据支持。比如是否可以通过瞬态吸收光谱等手段捕捉到关键的自由基中间体?与胺基团的成键相互作用能否通过光谱学或其他分析手段直接表征?
蛋白质工程的理性指导还不够精准。论文主要采用传统的定向进化方法,对于关键位点的筛选还是基于研究者的主观判断和盲筛结果。若能引入机器学习等智能算法,可望发现更多潜在的关键位点,加速酶催化剂的优化进程。
底物拓展实验选择的化合物类型还不够丰富,特别是缺乏具有实际应用价值的药物分子或农药活性成分。后续研究若能进一步验证该方法在这些目标分子合成中的有效性,将大大提升其应用价值。
论文缺少对成本效益和环境影响的深入分析。工业应用需要重点考察酶催化剂的生产成本、稳定性、重复使用性能等关键指标。此外,还需评估整个合成工艺的物料利用率、三废排放等,确保其能真正实现绿色可持续。
Biosyn导师：Todd K. Hyster（左一） https://hyster.princeton.edu/todd-hyster/#:~:text=In%20the%20Arnold%20group,%20Todd%20evolved%20P450s
Todd Hyster目前是普林斯顿大学化学系的教授。Todd出生于明尼苏达州,在明尼苏达大学完成了本科学习。2008年,他在科罗拉多州立大学师从Tomislav Rovis攻读博士学位,开发了铑催化的C-H活化反应。在攻读博士期间,Todd还在瑞士巴塞尔大学Thomas Ward的实验室进行了实习,为不对称C-H活化反应制备了人工金属酶。
毕业后,Todd以NIH博士后研究员的身份加入了加州理工学院Frances Arnold领导的实验室。在Arnold小组,Todd进化了P450酶以催化硝烯转移反应。
2015年,Todd以助理教授的身份加入普林斯顿大学化学系。2021年,他以化学和化学生物学副教授的身份加入康奈尔大学。在那里,Todd的团队开发了光化学策略来扩大常见酶的合成效用,使它们能够应对化学合成文献中长期存在的选择性挑战。
2023年,Todd重新加入普林斯顿大学担任化学教授。他在催化/合成领域重新开设实验室,专注于解决有机合成中长期存在的反应性挑战的新型生物催化方法。
